一种生物发酵法制备稳定同位素标记ssDNA的方法

本发明属于dna合成，具体涉及一种生物发酵法制备稳定同位素标记ssdna的方法。

背景技术：

1、大部分dna以双螺旋结构存在，是双链的存在形式，但一经热或碱处理就会变为单链状态。单链dna(single-stranded dna，ssdna)就是指以这种状态存在的dna。ssdna在分子流体力学性质、吸收光谱、碱基反应性质、三维结构及功能等方面都和双链dna(dsdna)不同。值得注意的是，ssdna可以折叠形成三维结构，在生命过程中扮演重要角色，例如g四链体结构被认为是一个有潜力的抗癌药物靶点。稳定同位素标记的ssdna可以促进ssdna的三维结构的核磁共振解析。

2、目前市场上获得稳定同位素标记ssdna的方法是固相合成法，但是该方法合成成本昂贵，合成一条24nt，1mg的ssdna链大约需要33万人民币。并且，对于高gc含量的样品，制备过程容易出现错乱现象或者二级结构阻碍聚合酶工作等问题。因此，发展普适性的稳定同位素标记ssdna的制备方法是该领域亟需解决的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种生物发酵法制备稳定同位素标记ssdna的方法，本发明的方法为普适性的稳定同位素15n和/或13c标记ssdna的方法，能够有效提高15n和/或13c标记的ssdna的体外合成效率，且降低合成成本。

2、本发明提供了一种生物发酵法制备稳定同位素标记ssdna的方法，包括以下步骤：

3、1)在目标序列5’和3’末端分别添加第一限制性内切酶的位点和第二限制性内切酶的位点，得到重复单元；

4、所述第一限制性内切酶和第二限制性内切酶为两个不同的限制性内切酶；

5、2)将步骤1)所述重复单元串联，得到融合序列；

6、3)将步骤2)所述融合序列插入到高拷贝载体，得到重组载体；

7、4)将步骤3)所述重组载体导入宿主菌，得到重组菌；

8、5)对步骤4)所述重组菌进行培养后，提取和纯化所述重组菌中的重组载体；所述培养采用的培养基以15nh4cl为唯一氮源和/或以13c-葡萄糖为唯一的碳源；

9、6)采用第一限制性内切酶和第二限制性内切酶对步骤5)所述重组载体进行酶切，得到不对称的双链dna结构，分离获得长度不等的两条ssdna，所述两条ssdna中一条为目标序列；

10、7)回收步骤6)所述两条ssdna中的目标序列，得到稳定同位素标记的靶ssdna。

11、优选的，步骤1)中，所述第一限制性内切酶为kpni且所述第二限制性内切酶为bamhi；或者，所述第一限制性内切酶为kpni-hf且所述第二限制性内切酶为bamhi-hf；或者，所述第一限制性内切酶为pst i-hf且所述第二限制性内切酶为hindⅲ-hf；或者，所述第一限制性内切酶为kpn i-hf且所述第二限制性内切酶为hind iii-hf。

12、优选的，步骤4)中长度不等的两条ssdna中长度短的一条为目标序列。

13、优选的，步骤2)中，每3～4个重复单元串联为1个大重复单元，大重复单元再通过接头序列串联。

14、优选的，步骤2)中，所述融合序列的长度≤2k。

15、优选的，步骤3)中，所述高拷贝载体包括puc57。

16、优选的，步骤1)中，所述目标序列包括端粒ssdna、人类启动子ssdna或hiv ssdna；所述端粒ssdna的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述人类启动子ssdna的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述hiv ssdna的核苷酸序列如seq id no.3所示。

17、优选的，当所述目标序列为端粒ssdna时，步骤2)中15个重复单元串联；当所述目标序列为人类启动子ssdna时，步骤2)中20个重复单元串联；当所述目标序列为hiv ssdna时，步骤2)中15个重复单元串联。

18、优选的，步骤5)中所述培养基中15nh4cl的浓度≥1g/l；所述培养基中13c-葡萄糖的浓度≥4g/l优选的，步骤7)还包括回收除目标序列的另一条ssdna。

19、本发明提供了一种生物发酵法制备稳定同位素标记ssdna的方法，本发明的方法将ssdna的目标序列重复串联在高拷贝载体上，并通过在目标序列5’和3’末端分别添加第一限制性内切酶的位点和第二限制性内切酶的位点，对重组载体进行酶切后，能够得到不对称的双链dna结构，进而分离获得长度不等的两条ssdna，其中包括15n和/或13c标记的靶ssdna，本发明的方法能够有效提高ssdna的产量，从而提高ssdna的体外合成效率。并且，本发明培养宿主菌采用的培养基以15nh4cl为唯一氮源和/或以13c-葡萄糖为唯一的碳源，能够有效降低稳定同位素标记dna的合成成本。

技术特征：

1.一种生物发酵法制备稳定同位素标记ssdna的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述第一限制性内切酶为kpni且所述第二限制性内切酶为bamhi；或者，所述第一限制性内切酶为kpni-hf且所述第二限制性内切酶为bamhi-hf；或者，所述第一限制性内切酶为pst i-hf且所述第二限制性内切酶为hindⅲ-hf；或者，所述第一限制性内切酶为kpn i-hf且所述第二限制性内切酶为hindiii-hf。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤4)中长度不等的两条ssdna中长度短的一条为目标序列。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，每3～4个重复单元串联为1个大重复单元，大重复单元再通过接头序列串联。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述融合序列的长度≤2k。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述高拷贝载体包括puc57。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述目标序列包括端粒ssdna、人类启动子ssdna或hiv ssdna；所述端粒ssdna的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述人类启动子ssdna的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述hiv ssdna的核苷酸序列如seq idno.3所示。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，当所述目标序列为端粒ssdna时，步骤2)中15个重复单元串联；当所述目标序列为人类启动子ssdna时，步骤2)中20个重复单元串联；当所述目标序列为hiv ssdna时，步骤2)中15个重复单元串联。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中所述培养基中15nh4cl的浓度≥1g/l；所述培养基中13c-葡萄糖的浓度≥4g/l。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤7)还包括回收除目标序列的另一条ssdna。

技术总结
本发明提供了一种生物发酵法制备稳定同位素标记的单链DNA(ssDNA)的方法，属于DNA合成技术领域。本发明的方法将ssDNA的目标序列重复串联在高拷贝载体上，并通过在目标序列5’和3’末端分别添加第一限制性内切酶的位点和第二限制性内切酶的位点，对重组载体进行酶切后，得到不对称的双链DNA结构，进而通过变性分离获得长度不等的两条ssDNA，其中包括<supgt;15</supgt;N或<supgt;13</supgt;C标记的靶ssDNA，本发明的方法能够有效提高ssDNA的产量，从而提高ssDNA的体外合成效率。并且，本发明培养宿主菌采用的培养基以价格相对廉价的<supgt;15</supgt;N标记的NH<subgt;4</subgt;Cl为唯一氮源和/或<supgt;13</supgt;C标记的葡萄糖为唯一碳源，能够有效降低合成成本。

技术研发人员：王申林,邹梦冰,马常兴
受保护的技术使用者：华东理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15