一种粘性体液中稀有细胞的分离鉴定方法与流程

本申请属于细胞分离，尤其涉及一种粘性体液中稀有细胞的分离鉴定方法。

背景技术：

1、获得临床相关的稀有细胞，可从细胞水平上进行多个层次的研究，包括基因组和转录组分析、蛋白表达水平、细胞代谢及激素水平等研究。目前与临床相关的稀有细胞研究主要集中在对外周血中循环肿瘤细胞、尿液中脱落细胞、脑脊液中稀有细胞、胸水中肿瘤细胞等的研究，这些体液为非粘性体液，样本本身呈单细胞悬液状态，处理较为简单，可直接进行离心或富集等操作。然而，临床中相关的一些人体粘性液体中的细胞，也具有非常重要的研究意义，但是这些细胞被包裹在粘液中，需要将细胞从粘液中释放后，才能对其进行研究。因此，取样后如何快速高效的消化粘液，获得完整无损坏的单细胞、制备成均匀的单细胞悬液，是后续实验能否顺利进行的关键步骤。例如，数据表明，在孕早期，胎儿绒毛外滋养层细胞会脱落游移至孕妇宫颈管中，被宫颈粘液包裹，因此孕早期采集孕妇宫颈可获得胎儿细胞。完整的胎儿细胞含有胎儿的完整基因组，与孕妇外周血中的游离基因片段用于无创产前检测相比更有优势，孕早期无创获得胎儿细胞，可实现对染色体疾病、单基因病、复杂多基因病、新发基因病等的检测。从宫颈粘液中分离得到胎儿滋养细胞是比传统的侵入性方法更好的选择，因为它更安全，且在妊娠早期就可以检测到。此外，它含有更多的胎儿细胞和更少的母血细胞的干扰，为分离胎儿细胞提供了优势。

2、如何快速地完成从临床门诊或手术室样本收集到实验室单细胞悬液制备，以及后续目的细胞的分离鉴定，这个过程决定着细胞的活性状态及检测效率。因此，急需一种能够快速完成粘性体液中稀有细胞的分离鉴定方法。

技术实现思路

1、为了克服上述技术问题，本申请提供了一种粘性体液中稀有细胞的分离鉴定方法，该方法可高效的在粘性体液中分离出稀有单细胞，且对较复杂的妇女宫颈粘液样本，同样地可以高效获得单细胞悬液，分离鉴定出目的细胞。

2、本申请提供的一种粘性体液中稀有细胞的分离鉴定方法，包括以下步骤：

3、步骤s1：粘性体液样本的采集；

4、步骤s2：将蛋白还原剂加入粘性液体样本中，混匀，孵育15-20分钟，得到消化后的单细胞悬液；

5、步骤s3：将所述单细胞悬液离心、重悬，将重悬后的单细胞悬液铺在微孔芯片或玻片上，待细胞沉降吸附后冲洗掉附着的细胞及杂质，获得细胞微孔芯片或玻片；

6、步骤s4：将所述细胞微孔芯片或玻片根据目的细胞表达的蛋白进行免疫染色，荧光成像后，取出阳性细胞单细胞至ep管中；

7、步骤s5：将获取的阳性细胞单细胞进行全基因组扩增后，进行基因组测序，与标准dna进行比对，即可鉴定稀有细胞的来源。

8、采用上述技术方案，通过使用蛋白还原剂对粘性体液样本进行消化，蛋白还原剂可以水解蛋白二硫键，实现粘液中单细胞之间的分散，并结合微孔芯片或玻片沉降附着，可以在短时间内快速实现稀有细胞的分离。

9、优选地，所述粘性体液为鼻腔粘液、痰液或妇女宫颈粘液。

10、本申请的方法针对鼻腔粘液、痰液或妇女宫颈粘液中的稀有细胞分离而言快速且高效。

11、优选地，步骤s1中所述采集为将粘性体液样本置于缓冲液hbss或pbs中。

12、优选地，步骤s2与步骤s1的间隔时间不超过1h。

13、采用上述技术方案，在粘性体液样本采集后1h内进行消化，此时的消化效率最高，如果样本放置较长时间后再消化，易出现难以完全消化、出现絮状物等现象，且影响细胞完整性。

14、优选地，步骤s2中所述蛋白还原剂为二硫苏糖醇(dtt)、β-巯基乙醇(bme)、三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐(tcep-hcl)。

15、优选地，步骤s2中所述蛋白还原剂的终浓度为0.6％。

16、优选地，步骤s2中所述消化的体系体积为10-15ml，消化的时间为15-20min。

17、采用上述技术方案，消化的时间过短则可观察到消化效果较差，消化体系体积在4-8ml之间，消化时间15-20分钟之间，得到的单细胞悬液分散性最好，且无明显细胞碎片出现。

18、优选地，步骤s3中所述离心条件为300g/min，离心5min，所述重悬为用缓冲液hbss或pbs重悬。

19、本申请相对于现有技术而言，提供了一种可高效、快速处理临床粘性体液及目的细胞的分离鉴定方法，并以孕早期孕妇宫颈粘液样本为例，提供了完整的样本采集、处理、铺片、目的细胞鉴定及分离流程，此流程高效、快速，且分离到的单细胞状态佳，可成功的进行基因组胎源性鉴定。

技术特征：

1.一种粘性体液中稀有细胞的分离鉴定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的分离鉴定方法，其特征在于，所述粘性体液为鼻腔粘液、痰液或妇女宫颈粘液。

3.根据权利要求1所述的分离鉴定方法，其特征在于，步骤s1中所述采集为将粘性体液样本置于缓冲液hbss或pbs中。

4.根据权利要求1所述的分离鉴定方法，其特征在于，步骤s2与步骤s1的间隔时间不超过1h。

5.根据权利要求1所述的分离鉴定方法，其特征在于，步骤s2中所述蛋白还原剂为二硫苏糖醇（dtt）、β-巯基乙醇（bme）、三-（2-甲酰乙基）膦盐酸盐（tcep-hcl）。

6.根据权利要求1所述的分离鉴定方法，其特征在于，步骤s2中所述蛋白还原剂的终浓度为0.6%。

7.根据权利要求1所述的分离鉴定方法，其特征在于，步骤s2中所述消化体系的体积为4-8 ml，消化的时间为15-20min。

8.根据权利要求1所述的分离鉴定方法，其特征在于，步骤s3中所述离心条件为300g/min，离心5min，所述重悬为用缓冲液hbss或pbs重悬。

技术总结
本申请属于细胞分离技术领域，公开了一种粘性体液中稀有细胞的分离鉴定方法，包括步骤S1：粘性体液样本的采集；步骤S2：将蛋白还原剂加入粘性液体样本中进行消化；步骤S3：将消化后的单细胞悬液离心、重悬，并铺在微孔芯片或玻片上，待细胞沉降吸附后冲洗掉附着的细胞及杂质，获得细胞微孔芯片或玻片；步骤S4：将所述细胞微孔芯片或玻片根据目的细胞表达的蛋白进行免疫染色，荧光成像后，取出阳性细胞单细胞至EP管中；步骤S5：获取的阳性细胞单细胞进行全基因组扩增后，进行基因组测序，与标准DNA进行比对，即可鉴定稀有细胞的来源。该方法可高效的在粘性体液中尤其是妇女宫颈粘液样本分离出稀有单细胞悬液，鉴定出目的细胞。

技术研发人员：贺其志,王春英,王卓
受保护的技术使用者：上海市第一妇婴保健院
技术研发日：
技术公布日：2024/2/1