人IL-1β突变体及其应用的制作方法

本发明属于蛋白质工程，具体涉及一种人il-1β突变体及其应用。

背景技术：

1、白细胞介素1(il-1)包括两个基因：il-1α和il-1β，il-1β前体被胞质半胱天冬酶1(白介素1β转化酶)裂解形成成熟的白细胞介素1β(il-1β)，il-1β又称淋巴细胞激活因子，是一种在人体内由il1b基因编码的细胞因子蛋白。

2、il-1β是白细胞介素1细胞因子家族的成员，这种细胞因子由活化的巨噬细胞作为前蛋白产生，被半胱天冬酶1(casp1/ice)蛋白水解加工成其活性形式，是炎症反应的重要介质，参与多种细胞活动，包括细胞增殖、分化和凋亡。有研究发现该细胞因子在中枢神经系统(cns)中诱导环氧合酶-2(ptgs2/cox2)导致炎症性疼痛过敏。il-1β基因和其他8个白细胞介素1家族基因在2号染色体上形成细胞因子基因簇。il-1β与il-23结合，可诱导γδt细胞表达il-17、il-21和il-22。这种表达诱导是在没有额外信号的情况下进行的，表明il-1β参与调节自身免疫性炎症。具体来说，炎症小体识别危险信号并激活促炎过程和il-1β和il-18的产生。il-1β被认为是典型的多功能细胞因子，几乎影响所有类型的细胞，无论是单独作用还是与其他细胞因子联合使用。il-1β对几乎所有组织的细胞防御和组织修复至关重要，与疼痛、炎症和自身免疫有关。il-1β也参与神经保护、组织重塑和修复。

3、人体中il-1β的检测需要制备高亲和力和高纯度的单克隆抗体。目前国内外针对il-1β单克隆抗体的纯化主要是偶联il-1β抗原的亲和层析柱、proteina柱、proteing柱等，其中，proteina柱、proteing柱纯化收率和相对纯度较低。偶联il-1β抗原的亲和层析柱纯化的单抗具有特异性好、纯度相对较高的优势，但是，由于il-1β抗原亲和柱与抗体结合力强，对抗体的洗脱非常困难，收率较低。

技术实现思路

1、本发明的目的在于解决现有技术中存在的il-1β抗原亲和柱与抗体结合力强，导致对抗体的洗脱非常困难且收率较低的问题，提出一种人il-1β突变体及其应用，通过改变蛋白结构，降低其与il-1β单克隆抗体的亲和力，并利用这一特点制备il-1β单克隆抗体纯化使用的亲和层析柱，该亲和层析柱以sepharose 4b为载体，偶联il-1β突变体，可以快速、高效的得到高纯度il-1β单克隆抗体。

2、本发明的技术方案是：

3、本发明提供了一种人il-1β突变体，其氨基酸序列如seq id no:8所示。该突变蛋白的突变位点为k16n，l26r，v41e。

4、进一步的，所述的人il-1β突变体的编码基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。

5、本发明还提供了用于构建所述人il-1β突变体的突变引物对，包括k16n突变引物对、l26r突变引物对和v41e突变引物对；采用上述3对突变引物对对il-1β蛋白进行定点突变，获得人il-1β突变体的如seq id no:1所示的编码基因。

6、所述k16n突变引物对的上游引物序列如seq id no:2所示；其下游引物序列如seqid no:3所示；

7、所述l26r突变引物对的上游引物序列如seq id no:4所示；其下游引物序列如seqid no:5所示；

8、所述v41e突变引物对的上游引物序列如seq id no:6所示；其下游引物序列如seqid no:7所示；

9、上述突变引物对以seq id no:10所示序列的il-1β基因为扩增模板。

10、本发明还提供了上述人il-1β突变体在制备偶联il-1β抗原的亲和层析柱中的应用。

11、进一步的，所述人il-1β突变体作为抗原。

12、本发明还提供了一种亲和层析柱，用于人il-1β抗体纯化使用，所述亲和层析柱以琼脂糖凝胶颗粒为载体，偶联权利要求1所述的人il-1β突变体蛋白。

13、本发明的有益效果：

14、(1)本发明提供了一种人il-1β突变体，通过蛋白构象的改变，降低了与il-1β抗体的亲和性；采用这种突变体制备的亲和层析柱在纯化特异性的il-1β抗体时，在二者结合率变化不大的前提下，变得更容易洗脱分离，纯化的抗体纯度高，回收率大大提升。

15、(2)本发明通过对il-1β蛋白突变，经过大量筛选，确定了c端的k16n，l26r，v41e突变位点能引起il-1β抗原与抗体亲和力的减弱，基于此制备一种适用于il-1β单克隆抗体纯化使用的亲和层析柱，可以快速、高效的得到高纯度il-1β单克隆抗体。

技术特征：

1.一种人il-1β突变体，其氨基酸序列如seq id no:8所示。

2.权利要求1所述的人il-1β突变体的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。

3.用于构建权利要求1所述人il-1β突变体的突变引物对，其特征在于，所述突变引物对包括k16n突变引物对、l26r突变引物对和v41e突变引物对；

4.权利要求1所述的人il-1β突变体在制备偶联il-1β抗原的亲和层析柱中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述人il-1β突变体作为抗原。

6.一种亲和层析柱，用于人il-1β抗体纯化使用，其特征在于，所述亲和层析柱以琼脂糖凝胶颗粒为载体，偶联权利要求1所述的人il-1β突变体蛋白。

技术总结
本发明属于蛋白质工程技术领域，具体涉及一种人IL‑1β突变体及其应用，人IL‑1β突变体的氨基酸序列如SEQ ID No:8所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，其作为抗原用于制备偶联IL‑1β抗原的亲和层析柱。本发明通过改变蛋白结构，降低人IL‑1β突变体与IL‑1β单克隆抗体的亲和力，并利用这一特点制备IL‑1β单克隆抗体纯化使用的亲和层析柱，该亲和层析柱以sepharose 4b为载体，偶联IL‑1β突变体，可以快速、高效的得到高纯度IL‑1β单克隆抗体。

技术研发人员：王硕硕,宁平,孙谧
受保护的技术使用者：青岛瑞斯凯尔生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15