一种利用烟草毛状根高效扩繁AM真菌孢子的方法与流程

本发明涉及植物组织培养及微生物培养，尤其涉及一种利用烟草毛状根高效扩繁am真菌孢子的方法。

背景技术：

1、由于am真菌专性共生这一特性，使其目前尚未实现无宿主培养，早期am真菌各种培养方法都依托于与完整的植物体建立共生体系的前提下，包括植物土壤盆栽法，营养液膜法、汽雾栽培法、培养基培养法等。

2、目前土壤盆栽法是常用的am真菌扩繁和菌剂制备的主要方法，但这种方法费时费力、污染率高，无法获得纯净的am真菌孢子，这限制了后续am真菌与宿主植物共生机理、am真菌纯培养及提高宿主抗逆性，同时植物毛状根与am真菌建立了共生体系，但都普遍新生孢子体积小、产量低、孢子难以成熟等问题。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了解决现有技术中以下缺点，植物毛状根与am真菌建立了共生体系，但都普遍新生孢子体积小、产量低、孢子难以成熟等问题，而提出的一种利用烟草毛状根高效扩繁am真菌孢子的方法。

2、为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

3、一种利用烟草毛状根高效扩繁am真菌孢子的方法，包括以下步骤：

4、s1:将发根农杆菌进行活化培养，烟草毛状根的诱导；首先将烟草种子用洗洁精浸泡5min，流水冲洗干净后，用75％酒精和10％次氯酸钠消毒液表面灭菌，后用无菌水冲洗干净转入ms固体培养基中，于25℃，14h/d光照培养获得无菌苗,将烟草叶片切成约为1.5cm×1.5cm左右大小后，放置于ms固体培养基上，预培养3天后放入制备好的侵染液中8min，取出叶片放置于无菌滤纸上吸干菌液，转入共培养培养基中，在25℃暗下培养3d,而后将叶片转移到含有抗生素的抑菌培养基中，并逐渐降低抗生素的浓度，直至毛状根周围不再有发根农杆菌，待毛状根稳定后转入1/2ms(不含激素和抗生素)的固体培养基中进行继代培养；

5、s2:装有孢子的离心管表面喷洒酒精后置于超净工作台中，加入无菌水反复冲洗5次,冲洗完毕后加入75％酒精消毒后，再次用无菌水反复冲洗5次,再分别加入2％氯胺t(w/v)+0.25％tween-20(v/v)混合制成的a液和0.02％硫酸链霉素(w/v)+0.01％硫酸庆大霉素(w/v)混合制成b液消毒处理后，用无菌水冲洗5次，最后将孢子放置于无菌滤纸上吸干水分，并立即用牙签将孢子逐一接种到萌发培养基中；

6、s3:将烟草毛状根转移到共生培养基上，再将am真菌孢子表面消毒及萌发后得到的萌发am真菌孢子按照打孔补位法接种到烟草毛状根根尖处，于25℃暗培养，待孢子萌发菌丝侵入毛状根后建立双重培养体系；

7、s4:在共培养4个月后将含有新生孢子及菌丝的培养基转移到新的共培养培养基上。

8、优选的，发根农杆菌进行活化培养的方法：将发根农杆菌画线接种于yeb固体培养基中培养48h后，挑取单菌落于yeb液体培养基中振荡培养12h，再将1ml菌液转移至yeb培养液中扩大培养至od600值为0.6～0.8。

9、优选的，发根农杆菌选用c58c1发根农杆菌。

10、优选的，共培养的培养基为ms培养基、ph 5.8-6.0，培养温度为25℃，培养时间为3天。

11、优选的，抑菌培养基包括ms培养基、500mg/l头孢霉素、500mg/l特美汀，抑菌培养基的ph 5.8-6.0。

12、优选的，除菌培养基包括ms培养基、30mg/l利福平、500mg/l头孢霉素、500mg/l特美汀，除菌培养基的ph 5.8-6.0。

13、优选的，孢子消毒条件为先用75％酒精消毒30-60s，2％氯胺t(w/v)+0.25％tween-20(v/v)混合制成的a液处理时间为8-12min，而0.02％硫酸链霉素(w/v)+0.01％硫酸庆大霉素(w/v)混合制成b液处理时间为8-12min。

14、优选的，孢子萌发培养基包括0.8％水琼脂、450pg/l独脚金内酯gr24。

15、优选的，共生培养基包括msr培养基、10mmol/l2-吗啉乙磺酸、450pg/l独脚金内酯gr24、植物凝胶，培养基ph 5.8-6.0。

16、优选的，打孔补位法包括：利用直径为0.5cm的无菌打孔器在毛状根旁边打孔，并移除培养基，再用另一个同样孔径的无菌打孔器将萌发的孢子连同培养基取出，并转移到毛状根旁的孔径中，尽量让菌丝生长的方向正对着烟草毛状根。

17、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

18、1、通过在培养基中添加一定浓度的gr24，可以有效刺激亲代amf孢子的萌发菌丝分支和提高孢子产量。

19、2、同时结合传统的孢子消毒条件，加上75％酒精消毒能够有效降低孢子的污染率。

20、3、可在3-4个月获得大量子代孢子，孢子密度大且无杂菌污染，可清晰观察记录am真菌辅助细胞及孢子形成过程，操作步骤简单，并且有助于在研究am真菌的生理学、遗传学以及am真菌与烟草共生分子机制领域具有广阔的应用前景。

技术特征：

1.一种利用烟草毛状根高效扩繁am真菌孢子的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种利用烟草毛状根高效扩繁am真菌孢子的方法，其特征在于，发根农杆菌进行活化培养的方法：将发根农杆菌画线接种于yeb固体培养基中培养48h后，挑取单菌落于yeb液体培养基中振荡培养12h，再将1ml菌液转移至yeb培养液中扩大培养至od600值为0.6～0.8。

3.根据权利要求1所述的一种利用烟草毛状根高效扩繁am真菌孢子的方法，其特征在于，发根农杆菌选用c58c1发根农杆菌。

4.根据权利要求1所述的一种利用烟草毛状根高效扩繁am真菌孢子的方法，其特征在于，共培养的培养基为ms培养基、ph5.8-6.0，培养温度为25℃，培养时间为3天。

5.根据权利要求1所述的一种利用烟草毛状根高效扩繁am真菌孢子的方法，其特征在于，抑菌培养基包括ms培养基、500mg/l头孢霉素、500mg/l特美汀，抑菌培养基的ph 5.8-6.0。

6.根据权利要求1所述的一种利用烟草毛状根高效扩繁am真菌孢子的方法，其特征在于，除菌培养基包括ms培养基、30mg/l利福平、500mg/l头孢霉素、500mg/l特美汀，除菌培养基的ph5.8-6.0。

7.根据权利要求1所述的一种利用烟草毛状根高效扩繁am真菌孢子的方法，其特征在于，孢子消毒条件为先用75％酒精消毒30-60s，2％氯胺t(w/v)+0.25％tween-20(v/v)混合制成的a液处理时间为8-12min，而0.02％硫酸链霉素(w/v)+0.01％硫酸庆大霉素(w/v)混合制成b液处理时间为8-12min。

8.根据权利要求1所述的一种利用烟草毛状根高效扩繁am真菌孢子的方法，其特征在于，孢子萌发培养基包括0.8％水琼脂、450pg/l独脚金内酯gr24。

9.根据权利要求1所述的一种利用烟草毛状根高效扩繁am真菌孢子的方法，其特征在于，共生培养基包括msr培养基、10mmol/l2-吗啉乙磺酸、450pg/l独脚金内酯gr24、植物凝胶，培养基ph5.8-6.0。

10.根据权利要求1所述的一种利用烟草毛状根高效扩繁am真菌孢子的方法，其特征在于，打孔补位法包括：利用直径为0.5cm的无菌打孔器在毛状根旁边打孔，并移除培养基，再用另一个同样孔径的无菌打孔器将萌发的孢子连同培养基取出，并转移到毛状根旁的孔径中，尽量让菌丝生长的方向正对着烟草毛状根。

技术总结
本发明涉及植物组织培养及微生物培养技术领域，尤其涉及一种利用烟草毛状根高效扩繁丛枝菌根真菌孢子的方法，包括以下步骤：首先利用发根农杆菌对烟草外植体叶片进行侵染，诱导出毛状根；在毛状根进行除菌培养后，进行继代与扩繁；截取绒毛丰富生长旺盛的毛状根于MSR培养基中，再将萌发的AM真菌孢子接种到烟草毛状根旁，于25℃暗培养，待菌丝侵入毛状根后建立双重培养体系，本发明通过在培养基中添加一定浓度的独脚金内酯类似物GR24，可以有效刺激亲代AMF孢子的萌发菌丝分支和提高孢子产量。

技术研发人员：卢燕回,韦学平,李俊霖,石保峰,卢昌友,首安发
受保护的技术使用者：中国烟草总公司广西壮族自治区公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15