一种油茶原生质体的分离方法及瞬时转化方法

本发明涉及生物，特别是涉及一种油茶原生质体的分离方法及瞬时转化方法。

背景技术：

1、油茶(camellia oleifera abel.)，是一种具有高油脂含量的山茶科山茶属植物，还是一种中国特有的重要的经济型木本食用油料植物，与油棕、橄榄、椰子同为世界四大木本食用油源树种。茶油中富含维生素和不饱和脂肪酸，营养价值很高。除油茶籽可榨取茶油外，油茶的其他部分也可作为许多工业的原料，具有很高的经济效益。在目前的油茶品种中，油茶的产量和抗性还有提升的可能，但油茶的幼年期较长，常规育种较为低效。探究油茶原生质体的制备方法，建立油茶原生质体的瞬时表达体系，将有助于克服传统育种的局限性。

2、原生质体是具有细胞全能性和生命活性的裸体植物细胞，由于其去除了细胞壁，可作为接受外源性细胞器和核酸的合适材料，通过转入特定的目的基因，能够改良作物的产量与抗性。植物原生质体为植物生物技术的一些重要领域的研究提供了单细胞方法，如体细胞杂交、体细胞突变、基因操作、植物基因的功能鉴定和基因组编辑，原生质体还可广泛应用于植物瞬时表达分析。植物原生质体的提取方法主要有两种，一种是机械分离，一种是酶分解法。但由于机械分离方法对分生组织和液泡化程度不高的细胞不适用，并且分离出的原生质体数量较少，导致在此领域的研究进展较为缓慢，因此目前已经基本不使用。而酶分离法，受到许多因素的影响，其中最重要的影响因素包括了以下几个方面：植物材料的选择、预处理的方式、酶解液的组成以及酶解条件和纯化方法等。因此导致目前在油茶原生质体分离方面的研究很少，只在近年才有几篇研究发表，另外在油茶的瞬时表达体系构建方面的研究也鲜有报道，因此建立油茶原生质体的制备和瞬时表达体系具有重要意义，可为油茶体细胞杂交育种和转基因研究奠定良好的基础。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种油茶原生质体的分离方法及瞬时转化方法，以解决上述现有技术存在的问题，通过优化原生质体的分离条件，筛选出最适的油茶原生质体分离的方法，同时利用peg介导法建立油茶原生质体瞬时转化体系，可为油茶进行原生质体再生，以及通过原生质融合、原生质体转化创制油茶新品种奠定基础。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种油茶原生质体的分离方法，包括以下步骤：

4、以油茶幼嫩的叶片为材料，进行预处理后，加入酶液进行酶解，得到酶解液；

5、用w5溶液终止酶解，得到原生质体-酶混合液，经过滤、离心，收集沉淀，再用w5溶液清洗所述沉淀后，用mmg溶液重悬，得到油茶原生质体；

6、其中，所述酶液包括以下组分：纤维素酶、离析酶、果胶酶、半纤维素酶、崩溃酶、甘露醇、kcl、mes、cacl2、bsa和水。

7、优选的是，所述预处理为：以油茶组培苗幼嫩的叶片为材料，切去所述叶片的两边与叶缘，将所述叶片中间部分切为0.5～1mm宽的细条。

8、优选的是，所述酶解的条件为：先避光真空处理30min，再于50r/min转速下25℃避光酶解10h。

9、优选的是，所述酶液包括以下组分：纤维素酶20g/l、离析酶25g/l、果胶酶10g/l、半纤维素酶5g/l、崩溃酶5g/l、甘露醇72.87g/l、kcl 1.49/l、mes 3.90g/l、cacl2 1.11g/l和bsa 1g/l。

10、优选的是，所述w5溶液包括以下组分：nacl 154mmol/l、cacl2 125mmol/l、kcl5mmol/l和mes2mmol/l；

11、所述mmg溶液包括以下组分：甘露醇0.4mol/l、mgcl2 15mmol/l和mes 4mmol/l。

12、本发明还提供一种油茶原生质体，由所述的分离方法分离得到。

13、本发明还提供一种所述的油茶原生质体的瞬时转化方法，包括以下步骤：

14、将油茶原生质体与质粒混合后，加入peg溶液，混匀后静置5-25min，完成转化。

15、优选的是，所述油茶原生质体与质粒的体积质量比为200μl：(10-20)μg；所述油茶原生质体与质粒的混合液和所述peg溶液的体积比为1：1。

16、优选的是，所述peg溶液包括以下组分：peg-4000 400g/l、甘露醇0.4mol/l、cacl20.2mol/l，加ddh2o定容至1l。

17、优选的是，所述质粒包括cobhlh25基因融合gfp的质粒。

18、本发明公开了以下技术效果：

19、本发明通过对油茶不同的组织材料(叶片，胚根，上胚轴)、不同酶液组成、不同酶解时间(7h，10h，13h)、不同油茶物种(高州油茶，香花油茶，广宁红花油茶，普通油茶)对原生质体分离的效果进行研究，筛选出分离油茶原生质体的最适条件，在酶液成分为2.0％纤维素酶、2.5％离析酶、1.0％果胶酶、0.5％半纤维素酶和0.5％崩溃酶的情况下，选择油茶组培苗的叶片作试验材料，在黑暗、恒温、低转速酶解10h时，原生质体产量达到最多，为6.719×106个/gfw；并在此基础上，建立peg介导的瞬时转化方法，通过将纯化的原生质体通过peg转化25min后，将携带cobhlh25融合gfp的过表达载体转入油茶原生质体中进行瞬时表达，转化率可达44.7％，为油茶进行原生质体再生、融合和转化奠定了基础。

技术特征：

1.一种油茶原生质体的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的油茶原生质体的分离方法，其特征在于，所述预处理为：以油茶组培苗幼嫩的叶片为材料，切去所述叶片的两边与叶缘，将所述叶片中间部分切为0.5～1mm宽的细条。

3.如权利要求1所述的油茶原生质体的分离方法，其特征在于，所述酶解的条件为：先避光真空处理30min，再于50r/min转速下25℃避光酶解10h。

4.如权利要求1所述的油茶原生质体的分离方法，其特征在于，所述酶液包括以下组分：纤维素酶20g/l、离析酶25g/l、果胶酶10g/l、半纤维素酶5g/l、崩溃酶5g/l、甘露醇72.87g/l、kcl 1.49/l、mes 3.90g/l、cacl2 1.11g/l和bsa 1g/l。

5.如权利要求1所述的油茶原生质体的分离方法，其特征在于，所述w5溶液包括以下组分：nacl 154mmol/l、cacl2 125mmol/l、kcl 5mmol/l和mes 2mmol/l；

6.一种油茶原生质体，其特征在于，由权利要求1-5任一项所述的分离方法分离得到。

7.一种如权利要求6所述的油茶原生质体的瞬时转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.如权利要求7所述的油茶原生质体的瞬时转化方法，其特征在于，所述油茶原生质体与质粒的体积质量比为200μl：(10-20)μg；所述油茶原生质体与质粒的混合液和所述peg溶液的体积比为1：1。

9.如权利要求7所述的油茶原生质体的瞬时转化方法，其特征在于，所述peg溶液包括以下组分：peg-4000 400g/l、甘露醇0.4mol/l、cacl2 0.2mol/l，加ddh2o定容至1l。

10.如权利要求7所述的油茶原生质体的瞬时转化方法，其特征在于，所述质粒包括cobhlh25基因融合gfp的质粒。

技术总结
本发明公开了一种油茶原生质体的分离方法及瞬时转化方法，属于生物技术领域。本发明以油茶组培苗的幼嫩叶片、胚根和上胚轴与盆栽油茶的幼嫩叶片作为试验材料，对不同材料(叶片，胚根，上胚轴)、不同酶液组成、不同酶解时间(7h，10h，13h)、不同油茶物种(高州油茶，香花油茶，广宁红花油茶，普通油茶)对原生质体分离的效果进行研究，筛选出分离油茶原生质体的最适条件，并在此基础上，建立PEG介导的瞬时转化方法，将携带CobHLH25融合GFP的过表达载体转入油茶原生质体中进行瞬时表达。本发明可为油茶进行原生质体再生，以及通过原生质融合、原生质体转化创制油茶新品种奠定基础。

技术研发人员：叶思诚,丁海发,张立莎,朱智国
受保护的技术使用者：九江学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15