高稳定性超氧化物歧化酶突变体及其应用的制作方法

本发明涉及生物基因工程领域，特别涉及高稳定性超氧化物歧化酶突变体及其应用。

背景技术：

1、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，简称sod)是一种能够催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢过程的酶。它广泛存在于各类动物、植物、微生物中，是一种重要的抗氧化剂，对细胞生命活动具有重大意义。由于sod的特殊功效，其在医药、日用化工、食品、农业以及环保等领域具有广泛的应用价值。目前，sod临床应用主要集中在抗炎症方面(以类风湿以及放射治疗后引起的炎症病人为主)，此外对某些自身免疫性疾病(如红斑狼疮、皮肌炎)、肺气肿、抗癌和氧中毒等都有一定疗效；在食品工业主要用作食品添加剂和重要的功能性基料；在化妆品行业里主要用作抗炎、抗衰老的重要功能。

2、根据结合的金属离子类型不同，该酶可分为cu/zn-sod、mn-sod、fe-sod、ni-sod四种类型。mn-sod与fe-sod主要存在于原核生物中，二者序列及结构同源性很高，进化上相近；而cu/zn-sod存在于真核生物中，属于进化上的另一个分支。目前已开发的sod产品绝大部分都是cu/zn-sod，最早是从动物的血、肝中分离提取的，近年来植物来源的sod也有了大量相关报道。微生物来源的sod，尤其嗜热菌中分离的sod由于具有高稳定、稳定性好的特点，使其在化工应用中比常温酶具有更好的适用性，而越来越受到更多关注。嗜热sod具有极高的热稳定性、耐受物理、化学变性剂的优良特性，在工农业生产中具有巨大的应用价值，主要来源与自然界分离，原料受限，难以满足工业化需要。目前对sod进行生产加工以提高其热稳定性的方法主要有基因工程方法、研究sod模拟物、化学修饰、酶固定化等，但普遍存在改造手段技术繁琐，操作困难，适应性差，且其效果并不太明显等弊端和局限性，这些问题已严重影响到了嗜热sod的工业化进程。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了高稳定性超氧化物歧化酶突变体及其应用。本发明提供了具备高稳定性的重组突变型sod及其编码基因和应用，具有突变酶活显著提高，具有较高蛋白稳定性，高稳定等技术特点。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了高稳定性超氧化物歧化酶的突变体，其包括l260和/或v364位点突变。

4、在本发明的一些具体实施方案中，所述突变包括第260位l突变为i，第364位v突变为a。

5、在本发明的一些具体实施方案中，所述突变体的具有：

6、(i)、如seq id no.1所示的氨基酸序列；或

7、(ii)、在如(i)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或

8、(iii)、与如(i)或(ii)所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列。

9、本发明还提供了编码所述突变体的核酸分子。

10、本发明还提供了编码所述突变体的核酸分子，其具有：

11、(i)、如seq id no.2所示的核苷酸序列；或

12、(ii)、与(i)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(i)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

13、(iii)、与(i)或(ii)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(i)或(ii)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

14、(iv)、与(i)、(ii)或(iii)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。

15、本发明还提供了重组表达载体，包括所述核酸分子及骨架载体。

16、在本发明的一些具体实施方案中，所述骨架载体包括pet28a。

17、本发明还提供了重组菌，其包括所述重组表达载体。

18、在本发明的一些具体实施方案中，所述重组菌的宿主包括bl21(de3)。

19、本发明还提供了所述重组菌在制备高稳定性超氧化物歧化酶中的应用。

20、本发明还提供了所述突变体的制备方法，其包括基于所述重组菌制备所述突变体。

21、在本发明的一些具体实施方案中，所述突变体的制备方法包括如下步骤：

22、步骤1、诱导所述重组菌表达，离心收集菌体，超声破碎，收集破碎后上清；

23、步骤2、镍柱纯化，获得所述突变体粗品；

24、步骤3、g25脱盐柱脱盐，冻干，获得所述突变体。

25、在本发明的一些具体实施方案中，所述离心收集菌体包括在4℃条件下6000rpm，5min收集菌体。

26、在本发明的一些具体实施方案中，所述镍柱包括chelating sepharose镍鳌合柱。

27、在本发明的一些具体实施方案中，所述镍柱纯化的洗脱液包括20mm pb，500mmnacl和500mm咪唑，ph7.4。

28、以下任意项在制备热稳定的产品中的应用：

29、(i)、所述突变体；和/或

30、(ii)、所述制备方法制得的突变体。

31、在本发明的一些具体实施方案中，所述热稳定的温度包括50℃～100℃。

32、在本发明的一些具体实施方案中，所述热稳定的温度包括80℃。

33、本发明包括但不限于提供了如下有益效果：

34、1、突变型sod和未突变sod酶活分别为40000u/mg、19000u/mg，因此，经过突变酶活显著提高。

35、2、本发明提供的高稳定突变型sod，经过80摄氏度处理后，活性提高。

技术特征：

1.高稳定性超氧化物歧化酶的突变体，其特征在于，包括l260和/或v364位点突变。

2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变包括第260位l突变为i，第364位v突变为a。

3.编码如权利要求1或2所述突变体的核酸分子。

4.编码如权利要求1或2所述突变体的核酸分子，其特征在于，具有：

5.重组表达载体，其特征在于，包括如权利要求3或4所述的核酸分子及骨架载体。

6.重组菌，其特征在于，包括如权利要求5所述的重组表达载体。

7.如权利要求6所述的重组菌在制备高稳定性超氧化物歧化酶中的应用。

8.如权利要求1或2所述突变体的制备方法，其特征在于，包括基于如权利要求6所述的重组菌制备所述突变体。

9.如权利要求1或2所述突变体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

10.以下任意项在制备热稳定的产品中的应用：

技术总结
本发明涉及生物基因工程领域，特别涉及高稳定性超氧化物歧化酶突变体及其应用。本发明公开了具备高稳定性的重组突变型SOD及其编码基因和应用，以耐高温菌Anoxybacillus calidus的SOD序列为基础，将其编码蛋白的氨基酸序列中260L突变为I以及364V突变为A，从而提高SOD的活性、热稳定性，活性提高2倍，显著高于现有技术生产的SOD的活性，突变重组型SOD包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，还提供了在制备超氧化物歧化酶产品中的应用，特别是在医药、食品、化妆品等行业，本发明具有突变酶活显著提高，具有较高蛋白稳定性，高稳定等技术特点。

技术研发人员：孙林博,崔运涛,霍晶晶,张骊
受保护的技术使用者：元一（天津）生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15