本发明属于dna聚合酶，具体涉及一种taq dna聚合酶突变体、高保真dna聚合酶混合物和试剂盒。
背景技术：
1、taq dna聚合酶是一种从水生嗜热杆菌(thermus aquaticus)中提取的热稳定dna聚合酶，是pcr反应中最常用的酶之一。最初由saiki等人在1988年从温泉中分离得到，其分子量为94kda，由832个氨基酸组成，包括三个结构域，1-291：5'-3'核酸外切酶结构域；292-423：该结构域对应于poli的3'-5'核酸外切酶结构域，但不具有3'-5'核酸外切活性；424-832：5'-3'聚合酶活性结构域。taq dna聚合酶由于自身缺乏3'-5'核酸外切酶活性即校正活性，致使taq dna聚合酶保真性低，一般在10-5左右；而在pcr扩增时常因校正活性缺失造成碱基错配累积，导致taq dna聚合酶扩增产物片段短，一般在5kb以内。
2、为解决taq dna聚合酶的上述不足，采取的如热启动技术、优化反应条件、控制循环次数、设计合适的引物等改进措施，均难以改善taq dna聚合酶扩增产物片段短和保真性低的问题。而基于taq dna聚合酶自身的改进方面，1992年barnes(barnes wm.thefidelity of taq polymerase catalyzing pcr is improved by an n-terminaldeletion.gene.1992；112(1):29-35.)首次将全长taq dna聚合酶n端的236个氨基酸缺失构建的klentaq dna聚合酶，仍具有完整的5'-3'聚合酶活性，但该酶的持续合成能力比taqdna聚合酶低10倍，保真性却仅比taq dna聚合酶提高2倍。后续δ280、δ289等截短的klentaq dna聚合酶，在聚合酶活性和保真性方面均与δ236截短型差别不大(u.s.patent5436149；lawyer,1993)。1994年barnes(barnes w m.pcr amplification of up to 35kbdna with high fidelity and high yield from lambda bacteriophage templates[j].proceedings of the national academy of sciences,1994,91(6):2216-2220.)又以klentaq1 dna聚合酶(δ280截短)为主，添加少量具有3'-5'核酸外切酶活性的pfu dna聚合酶的混合物，在长度上虽可扩增35kb的lambda dna片段，但由于混合物中klentaq1 dna聚合酶和pfu dna聚合酶均具有5'-3'聚合酶活性，pfu dna聚合酶的3'-5'核酸外切酶校正活性被极大弱化，导致混合物的保真性仅为taq dna聚合酶的4-8倍左右。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种taq dna聚合酶突变体、高保真dna聚合酶混合物和试剂盒，提高dna聚合酶的保真性，满足taq dna聚合酶长片段和高保真性扩增的要求。
2、本发明提供了一种taq dna聚合酶突变体，所述taq dna聚合酶突变体相比于野生型taq dna聚合酶，含有以下2个突变位点：r660k和e507k。
3、优选的，所述taq dna聚合酶突变体的氨基酸序列如seq id no.1所示。
4、本发明还提供了编码上述taq dna聚合酶突变体的基因。
5、优选的，所述基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
6、本发明还提供了上述taq dna聚合酶突变体在提高taq dna聚合酶保真性中的应用。
7、本发明还提供了一种提高taq dna聚合酶保真性的方法，包括将上述taq dna聚合酶突变体与pfu dna聚合酶突变体混合；
8、所述pfu dna聚合酶突变体相比于野生型pfu dna聚合酶，含有以下2个突变位点：h147k和g387p。
9、优选的，所述混合时，所述taq dna聚合酶突变体与所述pfu dna聚合酶突变体的比值为2.5u：20～100ng。
10、更优选的，所述混合时，所述taq dna聚合酶突变体与所述pfu dna聚合酶突变体的比值为2.5u：20～60ng。
11、本发明还提供了一种高保真性的dna聚合酶混合物，包括上述taq dna聚合酶突变体和pfu dna聚合酶突变体；
12、所述pfu dna聚合酶突变体相比于野生型pfu dna聚合酶，含有以下2个突变位点：h147k和g387p。
13、本发明还提供了一种高保真pcr试剂盒，包括上述dna聚合酶混合物和pcr扩增缓冲液。
14、优选的，所述pcr扩增缓冲液包括以下浓度的组分：30～80mm tris-so4、10～30mm(nh4)2so4、1～2mm mgso4、1～2％glycerol、0.05～0.1％np40、0.05～0.1％tween-20，ph 8～10。
15、有益效果：本发明提供了一种taq dna聚合酶突变体，将所述taq dna聚合酶突变体与pfu dna聚合酶突变体，按照一定比例混合后，制备得到高保真性dna聚合酶混合物，所述高保真dna聚合酶混合物克服了taq dna聚合酶扩增产物片段短和保真性低的缺点与不足，分别以lambda dna和人基因组dna为模板，在优化的pcr扩增缓冲液中可以良好的扩增20kb和15kb的片段，且保真性为taq dna聚合酶的32倍，保真性大幅提升。
1.一种taq dna聚合酶突变体，其特征在于，所述taq dna聚合酶突变体相比于野生型taq dna聚合酶，含有以下2个突变位点：r660k和e507k。
2.根据权利要求1所述taq dna聚合酶突变体，其特征在于，所述taq dna聚合酶突变体的氨基酸序列如seq id no.1所示。
3.编码权利要求1或2所述taq dna聚合酶突变体的基因。
4.根据权利要求3所述基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
5.权利要求1或2所述taq dna聚合酶突变体在提高taq dna聚合酶保真性中的应用。
6.一种提高taq dna聚合酶保真性的方法，其特征在于，包括将权利要求1或2所述taqdna聚合酶突变体与pfu dna聚合酶突变体混合；
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述混合时，所述taq dna聚合酶突变体与所述pfu dna聚合酶突变体的比值为2.5u：10～100ng。
8.一种高保真性的dna聚合酶混合物，其特征在于，包括权利要求1或2所述taq dna聚合酶突变体和pfu dna聚合酶突变体；
9.一种高保真pcr试剂盒，其特征在于，包括权利要求8所述dna聚合酶混合物和pcr扩增缓冲液。
10.根据权利要求9所述高保真pcr试剂盒，其特征在于，所述pcr扩增缓冲液包括以下浓度的组分：30～80mm tris-so4、10～30mm(nh4)2so4、1～2mm mgso4、1～2％glycerol、0.05～0.1％np40、0.05～0.1％tween-20，ph 8～10。