牛结节性皮肤病病毒基因缺失毒株及其构建方法

本发明涉及牛结节性皮肤病病毒基因缺失毒株及其构建方法。

背景技术：

1、牛结节性皮肤病(lumpy skin disease，lsd)也叫做牛结节性皮炎、牛疙瘩皮肤病、牛结节疹等。是由牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus，lsdv)感染牛后所致的急性、亚急性或慢性传染病。主要临床特征为发热、消瘦、淋巴结肿大、皮肤水肿、局部形成坚硬的结节或溃疡。lsdv能感染各品种的牛，感染后导致病牛死亡、产能下降、经济价值下降，给经济造成严重损失。感染lsdv的牛是主要传染源，感染动物和节肢动物媒介的移动被认为是lsdv传播的主要风险因素。该病被woah列为必须报告疫病，被我国农业农村部列为二类动物疫病。该病目前尚无有效商品化疫苗，尽管山羊痘或绵羊痘弱毒疫苗对lsd的防控有一定作用，但其免疫效果没有用lsdv本身的疫苗免疫效果好。由于lsdv编码众多蛋白，且大多数蛋白功能未知，严重阻碍了对其致病机制的研究。因此，对lsdv的感染与致病机制进行深入研究，在lsdv防控方面具有积极意义。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了牛结节性皮肤病病毒基因缺失毒株及其构建方法。

2、本发明的牛结节性皮肤病病毒基因缺失毒株的构建方法，包括以下步骤：

3、s1，根据牛结节性皮肤病病毒lsdv基因序列设计左同源臂orf005和右同源臂orf008的上下游引物；

4、所述左同源臂orf005的上下游引物orf003-l-f和orf004-l-r分别包括ecor i酶切位点和kpn i酶切位点；所述右同源臂orf008的上下游引物orf009-r-f和orf010-r-r分别包括xba i酶切位点和hindiii酶切位点；

5、s2，构建转移载体puc57-lsdvδorf005-008-egfp质粒：

6、a)分别用步骤s1中的左同源臂orf005的上下游引物，以及右同源臂orf008的上下游引物，对牛结节性皮肤病病毒lsdv的dna进行pcr扩增，分别获得左同源臂和右同源臂的序列；

7、b)构建合成载体puc57-egfp，所述载体puc57-egfp的egfp上游包括左同源臂的两个酶切位点ecor i、kpn i，egfp下游包括右同源臂的两个酶切位点xba i、hindiii；将载体puc57-egfp与牛结节性皮肤病病毒lsdv的一侧同源臂用内切酶进行双酶切、连接和转化，得到的质粒再与另一侧同源臂用内切酶进行双酶切、连接和转化，得到转移载体puc57-lsdvδorf005-008-egfp质粒；

8、s3，利用同源重组方法，构建牛结节性皮肤病病毒lsdv orf005-008基因缺失毒株rlsdvδorf005-008。

9、作为优选，步骤s1中，所述左右同源臂orf005、orf008的上下游引物为：

10、orf003-l-f：5′-gtggaattccaatcctatagttcattatgatg-3′；

11、orf004-l-r：5′-gtgggtaccatgatagggttaatgaatccttataa c-3′；

12、orf009-r-f：5′-gtgtctagattatggaaatctatcacagatatattt ttc-3′；

13、orf010-r-r：5′-gtgaagcttgtaacataccagctatttgcgtttc-3′。

14、作为优选，步骤s2中，将载体puc57-egfp与左同源臂分别用ecor i及kpn i限制性内切酶进行双酶切、连接和转化，从而构建得到puc57-l-egfp；再将puc57-l-egfp与右同源臂用xba i及hind iii限制性内切酶进行双酶切、连接和转化，得到转移载体puc57-lsdvδorf005-008-egfp质粒。

15、作为优选，步骤s3中，用牛结节性皮肤病病毒lsdv感染bhk-21细胞，之后将步骤s2的puc57-lsdvδorf005-008-egfp质粒转染至bhk-21细胞，得到牛结节性皮肤病病毒基因缺失毒株rlsdvδorf005-008。

16、本发明提供牛结节性皮肤病病毒基因缺失毒株，是应用上述的方法制备得到的。

17、作为优选，将所述牛结节性皮肤病病毒基因缺失毒株在csf细胞或bhk-21细胞中进行传代培养；优选在bhk-21细胞中进行传代培养。

18、作为优选，将所述牛结节性皮肤病病毒基因缺失毒株在bhk-21细胞中培养72±4h后，进行传代。

19、作为优选，将所述牛结节性皮肤病病毒基因缺失毒株以0.1moi的病毒量感染bhk-21细胞。

20、本发明提供牛结节性皮肤病病毒lsdv orf006、lsdv orf008或lsdv orf096蛋白在制备抑制宿主天然免疫的产品中的应用。

21、作为优选，牛结节性皮肤病病毒lsdv orf006、lsdv orf008或lsdv orf096蛋白在制备抑制ifn-β启动子活性的产品中的应用；

22、作为进一步优选，牛结节性皮肤病病毒lsdv orf006、lsdv orf008或lsdv orf096蛋白在制备抑制cgas-sting激活的ifn-β启动子活性的产品中的应用。

23、本发明通过ifn-β双荧光素酶报告基因系统初步筛选出lsdv orf006、lsdvorf008和lsdv orf096蛋白具有抑制宿主天然免疫的功能，然后通过同源重组技术构建了rlsdvδorf005-008四基因缺失的重组病毒，该重组病毒能稳定传代，具有进一步试制新型疫苗的潜力，本发明为lsd防控技术研究奠定基础。

技术特征：

1.牛结节性皮肤病病毒基因缺失毒株的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤s1中，所述左右同源臂orf005、orf008的上下游引物为：

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤s2中，将载体puc57-egfp与左同源臂分别用ecor i及kpn i限制性内切酶进行双酶切、连接和转化，从而构建得到puc57-l-egfp；再将puc57-l-egfp与右同源臂用xba i及hind iii限制性内切酶进行双酶切、连接和转化，得到转移载体puc57-lsdvδorf005-008-egfp质粒。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤s3中，用牛结节性皮肤病病毒lsdv感染bhk-21细胞，之后将步骤s2的puc57-lsdvδorf005-008-egfp质粒转染至bhk-21细胞，得到牛结节性皮肤病病毒基因缺失毒株rlsdvδorf005-008。

5.牛结节性皮肤病病毒基因缺失毒株，是应用权利要求1-4任一项所述的方法制备得到的。

6.权利要求5所述的牛结节性皮肤病病毒基因缺失毒株的传代培养方法，其特征在于：将所述牛结节性皮肤病病毒基因缺失毒株在csf细胞或bhk-21细胞中进行传代培养；优选在bhk-21细胞中进行传代培养。

7.根据权利要求6所述的牛结节性皮肤病病毒基因缺失毒株的传代培养方法，其特征在于：将所述牛结节性皮肤病病毒基因缺失毒株在bhk-21细胞中培养72±4h后，进行传代。

8.根据权利要求6或7所述的牛结节性皮肤病病毒基因缺失毒株的传代培养方法，其特征在于：将所述牛结节性皮肤病病毒基因缺失毒株以0.1moi的病毒量感染bhk-21细胞。

9.牛结节性皮肤病病毒lsdv orf006、lsdv orf008或lsdv orf096蛋白在制备抑制宿主天然免疫的产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：牛结节性皮肤病病毒lsdv orf006、lsdvorf008或lsdv orf096蛋白在制备抑制ifn-β启动子活性的产品中的应用；

技术总结
本发明提供牛结节性皮肤病病毒基因缺失毒株的构建方法，包括以下步骤：根据牛结节性皮肤病病毒LSDV基因序列设计左右同源臂的上下游引物；构建转移载体pUC57‑LSDVΔORF005‑008‑EGFP质粒；利用同源重组方法，构建牛结节性皮肤病病毒LSDV ORF005‑008基因缺失毒株。本发明通过IFN‑β双荧光素酶报告基因系统初步筛选出LSDV ORF006和LSDV ORF008蛋白具有抑制宿主天然免疫的功能，通过同源重组方法构建了rLSDVΔORF005‑008四基因缺失的重组病毒，该重组病毒能稳定传代，具有进一步试制新型疫苗的潜力。

技术研发人员：殷相平,马小琴,孙跃峰,任善会,王相伟,王莎莎,陈豪泰
受保护的技术使用者：中国农业科学院兰州兽医研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/25