一种基于磁性纳米颗粒的受体高表达细胞膜药物筛选材料

本发明属于细胞膜药物筛选，涉及一种基于磁性纳米颗粒的受体高表达细胞膜药物筛选材料。

背景技术：

1、中药是中华民族的文化瑰宝，它凝聚了几千年来中国人民防病治病和养生保健的智慧。中药有效部位或成分是中药发挥药理作用的物质基础，它既揭示了中药在体内的作用规律，也增强了中药的临床药理作用，并且对于新药以及中药新产品的研发具有重要意义。但是中药目前存在着产地来源多样、炮制方法繁琐、组成成分复杂且作用机制不明确等问题。并且由于中药成分复杂，目前很多中药的有效成分还没有完全研究清楚，因此在实际研究中往往会选择已知并且易得的标志性化学成分，但是这些成分并不真正是中药的活性成分。因此，如何辨识和筛选出能够代表中药治疗效果的活性成分成为中药现代化研究的关键问题之一。

2、近年来，以生物材料为靶标筛选中药活性成分的研究方法成为热点，这种方法具有针对性强、灵敏度高的优点，还能辅助阐明药物的作用机制。其中，由于细胞膜具有能够复制生命系统单元整体表面特性的能力，因此以细胞膜为筛选工具的研究越来越受到关注。研究表明，至少60％的药物是与其特定的细胞膜受体相互作用从而发挥药效的，因此细胞膜受体是药物发现的主要靶标。细胞膜仿生材料显示出许多理想的特征，例如特异性靶向能力，膜蛋白的天然结构的保留和单层膜覆盖。随着细胞膜仿生材料研究工作的不断深入与扩展，将其应用于中药复杂体系的药物筛选体现出灵敏和快速等特点。

3、色谱方法-细胞膜色谱法(cell membrane chromatography，cmc)，将含靶标受体的活性细胞膜作为固定相，用液相色谱法研究药物与固定相上细胞膜受体的相互作用。该方法可以最大限度地保持细胞膜的整体性以及膜受体的立体结构和生物活性。中药复杂体系可不经分离步骤，直接在细胞膜色谱上实现活性筛选过程，这种基于多组分-多靶标相互作用的方法非常适用于中药复杂体系活性成分筛选研究。近年来，利用cmc法，对大量中药进行了活性成分的筛选。当固定相无机载体采用磁性纳米材料时，用细胞膜涂层磁性纳米材料所建立的细胞膜磁性微球固相萃取方法能够为药物筛选材料提供具有良好的磁响应性和特异性亲和能力，使细胞膜磁性材料与中药总提物快速分离。

4、细胞膜药物筛选方法以细胞膜涂层无机载体为技术路线，以活性筛选为导向，以中药复杂体系为研究目标，以分离目标组分为原则，实现了中药物质基础分析，具有特异性高，操作简便且作用机制明确的优点。然而细胞膜包裹微纳米材料的药物筛选方法都是基于生物材料的分析方法，其核心部件-细胞膜的活性决定了整个分析方法的筛选效能和应用价值。但是由于细胞膜表面表达多种膜受体，在制备过程中载体材料表面涂覆的细胞膜是非选择性的，导致最终制备的细胞膜仿生材料表面存在着多种能和不同药物结合的膜受体，降低了目标膜受体的纯度，影响目标膜受体对活性化合物的特异性筛选能力，削弱筛选方法的选择性。

5、近年来，基于基因工程的细胞膜仿生纳米载体的仿生设计策略发展迅速。通过基因修饰可以赋予细胞膜额外的功能配体，使得细胞膜仿生材料可以满足多功能和多任务的复杂生物系统的应用要求。亲和标签融合技术是利用基因工程技术将改造优化的亲和标签与目标蛋白融合表达，从而对目标蛋白进行荧光标记实时成像或者纯化的技术，它具有结合特异性强及通用性强的优点。其中，halo-tag是由细菌脱卤素酶(haloalkanedehalogenase，halo)改造的蛋白标签，可以特异性地与连接有不同功能基团的氯代烷烃配基共价结合。通过halo-tag蛋白标签与目的蛋白构建融合表达载体，能够保证遗传标记的特异性，并通过改变halo-tag配基实现不同的研究目的。

技术实现思路

1、本发明解决的技术问题在于提供一种基于磁性纳米颗粒的受体高表达细胞膜药物筛选材料，增强目标膜受体fgfr4对活性化合物的特异性筛选能力，提高筛选方法的选择性和灵敏度。

2、本发明是通过以下技术方案来实现：

3、一种基于磁性纳米颗粒的受体高表达细胞膜药物筛选材料，重组细胞膜上高表达目标膜受体，其n端融合表达halo-tag蛋白标签；

4、重组细胞膜通过halo-tag蛋白标签共价结合、反向包覆在氯代烷烃修饰的fe3o4@sio2磁性纳米颗粒上。

5、所述重组细胞膜上的目标膜受体为fgfr4受体；

6、重组细胞膜是反向包覆在氯代烷烃修饰的fe3o4@sio2磁性纳米颗粒上，充分暴露受体的酪氨酸激酶区域。

7、所述的fe3o4@sio2磁性纳米颗粒上还连接有链霉亲和素。

8、所述的氯代烷烃修饰的fe3o4@sio2磁性纳米颗粒通过以下途径制得：

9、1)通过法制备fe3o4@sio2磁性纳米粒子；

10、2)将fe3o4@sio2-nh2纳米颗粒羧基化得到fe3o4@sio2-cooh纳米颗粒；

11、3)将fe3o4@sio2-cooh纳米颗粒活化后与链霉亲和素共同孵育后，分离得到fe3o4@sio2-sa磁性纳米颗粒；

12、4)将fe3o4@sio2-sa磁性纳米颗粒与包含halotag配基的氯代烷烃修饰剂充分混合震荡，得到氯代烷烃修饰的fe3o4@sio2磁性纳米颗粒。

13、所述的重组细胞膜来自于慢病毒介导的含halo-tag标签的fgfr4重组质粒转染hacat细胞；

14、所述的含halo-tag标签的fgfr4重组质粒是将含有halo-tag标签的编码区插入fgfrr4的n端。

15、所述的重组质粒为重组质粒lv-efs>halo tag/hfgfr4/3xeaaak/egfp-pgk>puro。

16、所述的高密度细胞膜受体包覆的细胞膜磁性纳米材料在筛选抗肿瘤药物中的应用。

17、所述是从包括虎杖在内的中药中筛选抗肿瘤的活性化合物。

18、与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

19、本发明提供的基于磁性纳米颗粒的受体高表达细胞膜药物筛选材料，通过对目标膜受体亲和标签融合技术修饰，提高了重组目标膜受体的产量；利用细胞膜受体n-端融合的halo-tag蛋白标签，将含有目标膜受体的细胞膜片段特异性共价结合到氯代烷烃修饰的载体材料表面，保证了细胞膜药物筛选材料表面fgfr4的高密度；保证了细胞膜药物筛选材料上受体结合位点的全暴露，提高了方法对目标物质的选择性。

技术特征：

1.一种基于磁性纳米颗粒的受体高表达细胞膜药物筛选材料，其特征在于，重组细胞膜上高表达目标膜受体，其n端融合表达halo-tag蛋白标签；

2.如权利要求1所述的基于磁性纳米颗粒的受体高表达细胞膜药物筛选材料，其特征在于，所述重组细胞膜上的目标膜受体为fgfr4受体；

3.如权利要求1所述的基于磁性纳米颗粒的受体高表达细胞膜药物筛选材料，其特征在于，所述的fe3o4@sio2磁性纳米颗粒上还连接有链霉亲和素。

4.如权利要求1所述的基于磁性纳米颗粒的受体高表达细胞膜药物筛选材料，其特征在于，所述的氯代烷烃修饰的fe3o4@sio2磁性纳米颗粒通过以下途径制得：

5.如权利要求1所述的基于磁性纳米颗粒的受体高表达细胞膜药物筛选材料，其特征在于，所述的重组细胞膜来自于慢病毒介导的含halo-tag标签的fgfr4重组质粒转染hacat细胞；

6.如权利要求5所述的基于磁性纳米颗粒的受体高表达细胞膜药物筛选材料，其特征在于，所述的重组质粒为重组质粒lv-efs>halo tag/hfgfr4/3xeaaak/egfp-pgk>puro。

7.如权利要求1所述的基于磁性纳米颗粒的受体高表达细胞膜药物筛选材料，其特征在于，所述重组细胞膜与氯代烷烃修饰的fe3o4@sio2磁性纳米颗粒的共价结合为：

8.权利要求1所述的高密度细胞膜受体包覆的细胞膜磁性纳米材料在筛选抗肿瘤药物中的应用。

9.如权利要求5所述的应用，其特征在于，是从包括虎杖在内的中药中筛选抗肿瘤的活性化合物。

技术总结
本发明公开了一种基于磁性纳米颗粒的受体高表达细胞膜药物筛选材料，重组细胞膜上高表达目标膜受体，其N端融合表达Halo‑tag蛋白标签；重组细胞膜通过Halo‑tag蛋白标签共价结合、反向包覆在氯代烷烃修饰的Fe3O4@SiO2磁性纳米颗粒上。本发明制备高密度FGFR4细胞膜药物筛选材料，增强目标膜受体FGFR4对活性化合物的特异性筛选能力，提高筛选方法的选择性和灵敏度。

技术研发人员：解笑瑜,王嗣岑,卜羽思,潘晓艳,胡琪,史小莲
受保护的技术使用者：西安交通大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15