引物组、探针、检测试剂盒及其在制备检测猪流行性腹泻的产品中的应用的制作方法

本发明涉及生物检测领域，尤其涉及引物组、探针、检测试剂盒及其在制备检测猪流行性腹泻的产品中的应用。

背景技术：

1、猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒引起的一种能导致猪只腹泻、脱水、呕吐等症状的肠道传染性疾病。该病首次在比利时国家一个猪场中传播，但在2010年前，市面普遍使用的经典毒株pedv cv777疫苗能够对其产生有效的保护保护。但在2010年后，我国南部地区部分注射过疫苗的猪群仍旧暴发大规模的ped感染，ped开始在我国各地广为流行，给我国的养猪业造成巨大损失。

2、pedv为单股正链rna病毒，基因组全长28kb，包含s、m、n、e结构蛋白、orf3非结构蛋白、非编码区。其中的s基因是主要的毒力基因，全长大约4149bp，和其他引发猪只腹泻的冠状病毒相似。

3、由于临床上，ped与猪传染性胃肠炎的临床症状非常相似，导致但从临床发病情况，很难区分这两种疾病。目前市面针对pedv的诊断方法主要有：常规rt-pcr、荧光定量rt-pcr、elisa、病毒分离鉴定等。但是普通rt-pcr方法检测灵敏性不高，临床需要跑电泳，耗时较长，并且核酸染料对检测人员及环境造成污染；elisa检测方法，特异性及灵敏性均不高，且常有假阳性结果出现；病毒分离鉴定方法需要培养细胞，洁净度要求高，并且所需时间较长；荧光定量rt-pcr方法相较于其他方法，具有特异性高、灵敏性强的多方面优点。

4、为实现临床对猪流行性腹泻的防控，建立一种快速、灵敏、特异的荧光定量rt-pcr检测方法迫在眉睫。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了引物组、探针、检测试剂盒及其在制备检测猪流行性腹泻的产品中的应用。本发明所采用的pedv病毒荧光定量rt-pcr方法相比于普通pcr检测方法，具有操作简便，特异性强，敏感度高，重复性好等优点，对pedv病毒的临床检测具有重要的现实意义。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了引物组，所述引物组具有：

4、(1)、如seq id no:1和seq id no:2所示的核苷酸序列；或

5、(2)、与(1)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(1)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

6、(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(1)或(2)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

7、(4)、与(1)、(2)或(3)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。

8、本发明还提供了探针，所述探针具有：

9、(5)、如seq id no:3所示的核苷酸序列；或

10、(6)、与(5)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(5)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

11、(7)、与(5)或(6)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(5)或(6)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

12、(8)、与(5)、(6)或(7)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。

13、在本发明的一些实施方案中，上述探针的核苷酸序列的5’端连接荧光报告基团，3’端连接淬灭基团。

14、在本发明的一些实施方案中，上述探针中，所述荧光报告基团为fam，所述淬灭基团为bhq1。

15、本发明还提供了检测试剂，包括上述引物组和/或上述探针以及可接受的助剂。

16、在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂，还包括：taq master mix、阳性标准质粒、阳性标准质粒的引物组和模板；

17、所述阳性标准质粒的引物组具有如seq id no:4和seq id no:5所示的序列。

18、在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中所述探针的浓度为10μm，所述引物组的浓度为10μm。

19、在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中，上游引物的浓度为10μm，下游引物的浓度为10μm。

20、本发明还提供了检测试剂盒，包括上述检测试剂以及可接受的载体或装置。

21、本发明还提供了上述引物组、上述探针、上述检测试剂和/或上述检测试剂盒在制备检测猪流行性腹泻的产品中的应用。

22、在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述检测包括如下步骤：获得所述样品的cdna与上述检测试剂和/或上述检测试剂盒混合，扩增，根据cq值和扩增曲线，获得所述样品是否为阳性。

23、本发明的一些实施方案中，上述应用中所述扩增的程序包括：95℃30s；40个循环：95℃5s，55℃退火30s。

24、本发明的一些实施方案中，上述应用中所述扩增的体系包括：

25、

26、本发明提供了引物组，所述引物组具有：

27、(1)、如seq id no:1和seq id no:2所示的核苷酸序列；或

28、(2)、与(1)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(1)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

29、(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(1)或(2)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

30、(4)、与(1)、(2)或(3)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。

31、本发明的有益效果包括：

32、(1)、操作简单：本发明不需电泳、显色等过程，自动化程度高，一步实现扩增和检测。

33、(2)、特异性强：本发明能够特异性检测出猪流行性腹泻病毒，对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪传染性胃肠炎病毒等毒株的检测结果均为阴性，具有很好的特异性。

34、(3)、敏感性高：荧光检测技术是极其灵敏的检测技术，本发明用于猪流行性腹泻病毒的检测，其最低检测限为3.16×101copies/μl。

35、(4)、准确性高：本发明所使用的引物是针对猪流行性腹泻病毒s基因设计，能真实、准确地反应出猪流行性腹泻病毒含量。

36、(5)、本发明对产物可以实现定量：由于荧光信号的强弱和扩增产物量成线性对应关系，通过收集荧光信号可以实现产物的定量。

技术特征：

1.引物组，其特征在于，所述引物组具有：

2.探针，其特征在于，所述探针具有：

3.如权利要求3所述的探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列的5’端连接荧光报告基团，3’端连接淬灭基团。

4.检测试剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物组和/或如权利要求2或3所述的探针以及可接受的助剂。

5.如权利要求4所述的检测试剂，其特征在于，还包括：taq mastermix、阳性标准质粒、阳性标准质粒的引物组和模板；

6.如权利要求4或5所述的检测试剂，其特征在于，所述探针的浓度为10μm，所述引物组的浓度为10μm。

7.检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求4至6任一项所述的检测试剂以及可接受的载体或装置。

8.如权利要求1所述的引物组、如权利要求2或3所述的探针、如权利要求4至6任一项所述的检测试剂和/或如权利要求7所述的检测试剂盒在制备检测猪流行性腹泻的产品中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述检测包括如下步骤：获得所述样品的cdna与如权利要求4至6任一项所述的检测试剂和/或如权利要求7所述的检测试剂盒混合，扩增，根据cq值和扩增曲线，获得所述样品是否为阳性。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述扩增的程序包括：95℃30s；40个循环：95℃5s，55℃退火30s。

技术总结
本发明涉及生物检测领域，尤其涉及引物组、探针、检测试剂盒及其在制备检测猪流行性腹泻的产品中的应用。本发明提供了引物组，所述引物组具有：如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。本发明所采用的PEDV病毒荧光定量RT‑PCR方法相比于普通PCR检测方法，具有操作简便，特异性强，敏感度高，重复性好等优点，对PEDV病毒的临床检测具有重要的现实意义。

技术研发人员：牛旻,郭冠瑛,张娇蕊,李亚楠,李英英
受保护的技术使用者：牧原食品股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15