一种调控细胞成骨分化的调控方法

本发明涉及细胞成骨分化，尤其涉及一种调控细胞成骨分化的调控方法。

背景技术：

1、间充质干细胞(msc)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，属于一种多功能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，由于骨髓是其主要来源，因此又称为骨髓间充质干细胞。它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力，间充质干细胞最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注，间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为骨骼、软骨、脂肪、肌腱、韧带、神经、肝、心肌等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，

2、骨缺损在骨科中相当常见，创伤、炎症和骨肿瘤等原因导致的骨缺损难以自身愈合，骨缺损是骨科医师经常需要面对的重要挑战，目前骨缺损的治疗主要以骨移植为主。随着组织工程和再生医学的快速发展，通过诱导间充质干细胞成骨分化的治疗方式受到越来越大的关注，可诱导间充质干细胞成骨分化并促进缺损处骨再生，由此，一些调控间充质干细胞成骨分化的方法开始不断出现，例如公开号为cn107075476b的中国专利申请，其公开了“使用水凝胶诱导干细胞三维成骨分化的方法”，但是该方法是通过化学诱导的方式进行调控，这种采用诱导的方式调控间充质干细胞成骨分化的方式需要从外界获取信息，其成骨分化方向取决于所在的诱导方式的准确性以及成骨环境的稳定性，没有实现明确的成骨诱导效果，因此其调控过程比较漫长，操作难度大，存在着一定的不确定性，调控时间和成骨分化成本较高。

技术实现思路

1、为解决现有技术存在的采用化学诱导的方式调控间充质干细胞成骨分化的方式调控过程比较漫长，操作难度大，存在着一定的不确定性，调控时间和成骨分化成本较高的技术问题，本发明提供了如下技术方案。

2、本发明一种调控细胞成骨分化的调控方法，包括如下步骤：

3、s1：间充质干细胞扩增培养；取骨髓间充质干细胞在α-mem培养基中加入3％-10％的胎牛血清、链霉素100mg/l、青霉素100u/l,在满足36.8℃-37.5℃以及4％-5％co2的条件下培养扩增骨髓间充质干细胞；

4、s2：将骨髓间充质干细胞在六孔板中以每孔1×104个细胞的密度接种，用含5％-10％的无胎牛血清fbs和抗坏血酸30mg/l-50mg/l的培养基诱导间充质干细胞分泌骨髓来源的细胞外基质(ecm)，之后用非离子型表面活性剂及20mm nh4oh的磷酸缓冲盐溶液pbs进行脱细胞步骤，获得脱细胞后的骨髓来源的细胞外基质(ecm)；

5、s3：将骨髓间充质干细胞接种于含有所述细胞外外基质(ecm)的α-mem培养基中，诱导骨髓间充质干细胞成骨分化。

6、s4：对培养基环境增加电磁干涉和机械压力干涉，增加间充质干细胞的成骨分化速度。

7、作为进一步的技术方案，所述s1的步骤中每3-4天更换一次培养基。

8、作为进一步的技术方案，所述步骤s1中，每2-3天采用0.25％胰酶消化方式进行传代培养。

9、作为进一步的技术方案，在s3步骤中为了诱导成骨分化，在细胞达到80-90％融合时，培养基中加入10mmβ-甘油磷酸、100nm地塞米松和200μm抗坏血酸。

10、作为进一步的技术方案，所述步骤s4中，通过每12小时改变外加磁场引起细胞所处磁电微环境改变。

11、作为进一步的技术方案，所述外加磁场为动态变化的磁场，使细胞接受动态电磁微环境刺激。

12、作为进一步的技术方案，所述步骤s4中，所述机械压力干涉采用外部加压方式进行。

13、作为进一步的技术方案，所述机械压力模拟体内骨骼微环境的机械压力且持续供压。

14、作为进一步的技术方案，所述步骤s3中，用小干扰rna转染骨髓间充质干细胞，小干扰rna混合物转移到6孔板为36.8℃-37.5℃孵箱中孵育8小时,置换培养基后，将骨骼间充质干细胞培养在含有细胞外基质(ecm)的α-mem培养基中。

15、作为进一步的技术方案，所述步骤s3中，骨髓间充质干细胞成骨分化培养在二维平面上。

16、本发明的有益效果，本发明通过扩增间充质干细胞后，再培养间充质干细胞成骨分化所需的细胞外基质(ecm)，使间充质干细胞在成骨分化所需的微环境内生长并定向成骨分化；在成骨分化微环境内提供动态磁电微环境和机械应力环境，诱导间充质干细胞定向成骨分化的同时，使调控细胞成骨分化的过程相对缩短，提高成骨分化的调控效率；且间充质干细胞在细胞外基质(ecm)微环境内的动态磁电微环境和机械应力环境的作用下，其成骨分化准确性较高，且减小了操作难度，降低了调控时间和成骨分化的成本，使间充质干细胞定向成骨分化具有较佳的安全性及可控性。

技术特征：

1.一种调控细胞成骨分化的调控方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的调控细胞成骨分化的调控方法，其特征在于：所述s1的步骤中每3-4天更换一次培养基。

3.根据权利要求1所述的调控细胞成骨分化的调控方法，其特征在于：所述步骤s1中，每2-3天采用0.25％胰酶消化方式进行传代培养。

4.根据权利要求1所述的调控细胞成骨分化的调控方法，其特征在于：在s3步骤中为了诱导成骨分化，在细胞达到80-90％融合时，培养基中加入10mmβ-甘油磷酸、100nm地塞米松和200μm抗坏血酸。

5.根据权利要求1所述的调控细胞成骨分化的调控方法，其特征在于：所述步骤s4中，通过每12小时改变外加磁场引起细胞所处磁电微环境改变。

6.根据权利要求5所述的调控细胞成骨分化的调控方法，其特征在于：所述外加磁场为动态变化的磁场，使细胞接受动态电磁微环境刺激。

7.根据权利要求1所述的调控细胞成骨分化的调控方法，其特征在于：所述步骤s4中，所述机械压力干涉采用外部加压方式进行。

8.根据权利要求7所述的调控细胞成骨分化的调控方法，其特征在于：所述机械压力模拟体内骨骼微环境的机械压力且持续供压。

9.根据权利要求1所述的调控细胞成骨分化的调控方法，其特征在于：所述步骤s3中，用小干扰rna转染骨髓间充质干细胞，小干扰rna混合物转移到6孔板为36.8℃-37.5℃孵箱中孵育8小时,置换培养基后，将骨骼间充质干细胞培养在含有细胞外基质的α-mem培养基中。

10.根据权利要求1所述的调控细胞成骨分化的调控方法，其特征在于：所述步骤s3中，骨髓间充质干细胞成骨分化培养在二维平面上。

技术总结
本发明公开了一种调控细胞成骨分化的调控方法，包括如下步骤：S1：间充质干细胞扩增培养；S2：将骨髓间充质干细胞培养获得脱细胞后的骨髓来源的细胞外基质；S3：将骨髓间充质干细胞接种于含有所述细胞外外基质的α‑MEM培养基中，诱导骨髓间充质干细胞成骨分化；S4：对培养基环境增加电磁干涉和机械压力干涉，增加间充质干细胞的成骨分化速度。本发明使间充质干细胞在成骨分化所需的微环境内生长并定向成骨分化；在成骨分化微环境内提供动态磁电微环境和机械应力环境，使调控细胞成骨分化的过程相对缩短，提高成骨分化的调控效率和准确性，且减小了操作难度，使间充质干细胞定向成骨分化具有较佳的安全性及可控性。

技术研发人员：任义军,王翊凯
受保护的技术使用者：武汉大学人民医院（湖北省人民医院）
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15