一种工程化促血管生成外泌体及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物医学，具体是一种工程化促血管生成外泌体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、皮肤被覆于体表，是人体最大的器官，损伤后经历出血、炎症、增殖、重塑四个阶段，从而达到自我修复。创面愈合的基本过程如下：伤口局部有不同程度的组织坏死和血管断裂出血，数小时内便出现炎症反应，表现为充血、浆液渗出及白细胞游出，故局部红肿。伤口中的血液和渗出液中的纤维蛋白原很快凝固形成凝块，有的凝块表面干燥形成痂皮，起伤口保护作用。2-3日后边缘的整层皮肤及皮下组织向中心移动，这是由伤口边缘新生的肌成纤维细胞的牵拉作用引起的，于是伤口迅速缩小，直到14天左右停止。不过在各种具体情况下，伤口缩小的程度因伤口部位、伤口大小及形状而不同。大约从第3天开始从伤口底部及边缘长出肉芽组织填平伤口。毛细血管以每日延长0.1-0.6mm的速度增长。其方向大都垂直于创面，并呈袢状弯曲。肉芽组织中没有神经，故无感觉。第5～6天起成纤维细胞产生胶原纤维，其后一周胶原纤维形成甚为活跃，以后逐渐缓慢下来。随着胶原纤维越来越多，出现瘢痕形成过程，大约在伤后一个月瘢痕完全形成。

2、创面愈合的基本过程中，创伤发生的24小时内，伤口边缘及募集的表皮干细胞在凝块下面向伤口中心迁移，并增生、分化成为鳞状上皮。健康的肉芽组织对表皮再生十分重要，其内含有丰富的毛细血管以及成纤维细胞，可提供上皮再生所需的各种营养及生长因子。

3、然而，皮肤自我修复的能力是有限的，随着一些慢性病的患病率提高，糖尿病创面、压疮、下肢静脉性溃疡等慢性创面发生率也在增加，并且这些发生率高、复发率高的难愈合创面若长期存在，将会提高感染和死亡风险。各种慢性创面给患者带来沉重的经济负担和精神负担，严重影响患者及其家人的生活质量，因而成为医疗事业持续发展和人民社会生活水平稳步提升的一个重要挑战。

4、由于成熟组织的再生能力差，组织慢性损伤后的自我修复效果不理想，所以，外源性补充组织修复所需物质是重要的治疗手段之一。目前，细胞疗法作为一种切实可行的治疗手段应用在组织功能修复中，它的蓬勃发展也为再生医学开拓了一个新阶段。因此，目前亟待探索皮肤创面治疗的新思路。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种工程化促血管生成外泌体的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

3、一种工程化促血管生成外泌体的制备方法，其包括以下步骤：

4、取脐带血，提取细胞，将细胞转移至包被鼠尾i型胶原的培养板中培养，去掉未贴壁细胞，得到贴壁的内皮祖细胞，继续培养；

5、待内皮祖细胞培养成梭形后，置于基础培养基中进行饥饿处理，然后置于o2体积浓度为0.5％-2％的低氧环境下进行培养，得到内皮祖细胞促血管生成模型；

6、取内皮祖细胞促血管生成模型中富集外泌体的上清液，从中提取得到促血管生成外泌体。

7、优选地，提取细胞的方法为ficoll单个核细胞分离法。

8、优选地，包被鼠尾i型胶原的培养板的制作方法包括以下步骤：

9、利用0.01-0.03mol/l的冰乙酸将鼠尾来源的i型胶原溶解至40-60μg/ml的工作浓度，得到i型胶原溶液；

10、往培养板加入i型胶原溶液，静置后，取出培养板，沿着培养板孔的边缘吸尽液体后，加入pbs清洗，得到包被鼠尾i型胶原的培养板。

11、优选地，饥饿处理的时间为8-16h。

12、优选地，低氧环境的o2体积浓度为1％。

13、优选地，取内皮祖细胞促血管生成模型的富集外泌体的上清液，从中提取得到促血管生成外泌体的步骤，具体包括：

14、取内皮祖细胞促血管生成模型的富集外泌体的上清液，利用差速离心法去除上清液中的死细胞、细胞碎片及其他杂质，再经过超滤浓缩、过滤及超速离心处理，得到促血管生成外泌体。

15、本发明实施例的另一目的在于提供一种采用上述的工程化促血管生成外泌体的制备方法制得的促血管生成外泌体。

16、本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的促血管生成外泌体在制备用于治疗皮肤创面的药物中的应用。

17、本发明提供的工程化促血管生成外泌体的制备方法，可以从脐带血中分离得到的一种有促进血管生成能力的细胞，即内皮祖细胞；另外，本发明从内皮祖细胞中可以提取高浓度、高纯度的工程化有促血管生成功能的外泌体，其可用于治疗皮肤创面，为外泌体治疗皮肤创面提供思路和指导。

技术特征：

1.一种工程化促血管生成外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的工程化促血管生成外泌体的制备方法，其特征在于，提取细胞的方法为ficoll单个核细胞分离法。

3.根据权利要求1所述的工程化促血管生成外泌体的制备方法，其特征在于，包被鼠尾i型胶原的培养板的制作方法包括以下步骤：

4.根据权利要求1所述的工程化促血管生成外泌体的制备方法，其特征在于，饥饿处理的时间为8-16h。

5.根据权利要求1所述的工程化促血管生成外泌体的制备方法，其特征在于，低氧环境的o2体积浓度为1%。

6.根据权利要求1所述的工程化促血管生成外泌体的制备方法，其特征在于，取内皮祖细胞促血管生成模型的富集外泌体的上清液，从中提取得到促血管生成外泌体的步骤，具体包括：

7.一种采用权利要求1-6中任一项所述的工程化促血管生成外泌体的制备方法制得的促血管生成外泌体。

8.一种如权利要求7所述的促血管生成外泌体在制备用于治疗皮肤创面的药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种工程化促血管生成外泌体及其制备方法和应用，其属于生物医学技术领域，该制备方法包括以下步骤：取脐带血，提取细胞，将细胞转移至包被鼠尾I型胶原的培养板中培养，去掉未贴壁细胞，得到贴壁的内皮祖细胞，继续培养；待内皮祖细胞培养成梭形后，置于基础培养基中进行饥饿处理，然后置于O<subgt;2</subgt;体积浓度为0.5%‑2%的低氧环境下进行培养，得到内皮祖细胞促血管生成模型；取内皮祖细胞促血管生成模型中富集外泌体的上清液，从中提取得到促血管生成外泌体。本发明可以从脐带血中分离得到一种具备促进血管生成能力的细胞，即内皮祖细胞；另外，本发明从内皮祖细胞中可以提取出具有促血管生成功能的外泌体，其可用于治疗皮肤创面。

技术研发人员：谢玉霖,杨佳曼,范运龙,夏志宽,杨蓉娅,蔡媛媛,敖俊红
受保护的技术使用者：中国人民解放军总医院第七医学中心
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15