一种构建绿脓菌素型奶牛乳腺上皮细胞炎症模型方法

本发明属于兽医、兽药，具体涉及到一种构建绿脓菌素型奶牛乳腺上皮细胞炎症模型方法。

背景技术：

1、有研究表明，用绿脓菌素诱导小鼠巨噬细胞炎症，但未被用来构建奶牛乳腺上皮细胞炎症模型。[1]高月虹,刘梦茹,杨宪鑫等.芳香烃受体通过p38ma pk/p65nf-κb信号通路调节绿脓菌素诱导的巨噬细胞中炎症因子的表达[j].中国药理学通报,2023,39(07):1296-1302.。

2、对于建立奶牛乳腺炎症模型，通常都会使用乳腺炎病原菌诱导，或者对于革兰氏阴性菌，在实验中会用其特有的内毒素lps诱导乳腺炎症，有些病原菌自身会产生一些毒素，有些毒素也能引发炎症的产生。所以仅用lps模拟某些病原菌诱导奶牛乳腺炎不准确，且具有局限性。

3、绿脓菌素是由铜绿假单胞菌分泌的一种毒素，前期研究发现，绿脓菌素可以诱导奶牛乳腺上皮炎症，并且绿脓菌素诱导奶牛乳腺上皮炎症要比同浓度lps诱导的严重，说明铜绿假单胞菌在侵袭奶牛乳腺过程中，绿脓菌素可能发挥主要作用，所以根据研究结果，可以构建一种新的诱导奶牛乳腺上皮细胞炎症模型，而且铜绿假单胞菌诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎症的时候，额外添加绿脓菌素构建炎症模型更确切。

技术实现思路

1、本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

2、鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

3、因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种构建绿脓菌素型奶牛乳腺上皮细胞炎症模型方法。

4、为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种构建绿脓菌素型奶牛乳腺上皮细胞炎症模型方法，其包括如下步骤：

5、培养细胞：将奶牛乳腺上皮细胞置于培养基中进行培养；

6、细胞处理：使用绿脓菌素对于培养细胞中扩增得到的细胞进行处理。

7、作为本发明所述构建绿脓菌素型奶牛乳腺上皮细胞炎症模型方法的一种优选方案，其中：培养细胞中，培养基为dmem/f12培养基，其包括90％培养基和10％胎牛血清。

8、作为本发明所述构建绿脓菌素型奶牛乳腺上皮细胞炎症模型方法的一种优选方案，其中：培养细胞中，所述培养温度为37℃，co2浓度为5％。

9、作为本发明所述构建绿脓菌素型奶牛乳腺上皮细胞炎症模型方法的一种优选方案，其中：培养细胞中，培养基与细胞数量比为2ml：1×104个。

10、作为本发明所述构建绿脓菌素型奶牛乳腺上皮细胞炎症模型方法的一种优选方案，其中：细胞处理中，细胞培养至70％时进行绿脓菌素进行处理。

11、作为本发明所述构建绿脓菌素型奶牛乳腺上皮细胞炎症模型方法的一种优选方案，其中：细胞处理中绿脓菌素的处理浓度为0～5μg/ml

12、作为本发明所述构建绿脓菌素型奶牛乳腺上皮细胞炎症模型方法的一种优选方案，其中：细胞处理中绿脓菌素的处理浓度为1μg/ml。

13、作为本发明所述构建绿脓菌素型奶牛乳腺上皮细胞炎症模型方法的一种优选方案，其中：细胞处理中，绿脓菌素处理后的细胞相较相同条件lps处理的细胞具有更好的早期凋亡率和晚期凋亡率。

14、作为本发明所述构建绿脓菌素型奶牛乳腺上皮细胞炎症模型方法的一种优选方案，其中：细胞处理中，绿脓菌素处理后的细胞相较相同条件lps处理的细胞具有更高的il-1β、tnf-α表达量。

15、作为本发明所述构建绿脓菌素型奶牛乳腺上皮细胞炎症模型方法的一种优选方案，其中：细胞处理中，绿脓菌素处理后的细胞相较相同条件lps处理的细胞的p65荧光强度更高。

16、本发明有益效果：

17、1)本发明首次证明了绿脓菌素诱导奶牛乳腺上皮细胞炎症反应中的应用。相比于现有关于乳腺上皮细胞炎症反应模型构建的研究，本发明从细胞层面证明了绿脓菌素对奶牛乳腺上皮细胞的免疫调控作用，并且提高了细胞炎症因子的基因表达量，促进细胞凋亡和氧化应激反应，因而具有更高的准确性和可信度，且绿脓菌素诱导炎症效果要比lps好。

18、2)本发明证明了绿脓菌素在浓度为1μg/ml时可诱导奶牛乳腺上皮细胞产生炎症反应，炎症模型构建成功。流式细胞仪检测细胞凋亡率升高、免疫因子的基因表达量增加，因而具有更高的可行性。

技术特征：

1.一种构建绿脓菌素型奶牛乳腺上皮细胞炎症模型方法，其特征在于：包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的构建绿脓菌素型奶牛乳腺上皮细胞炎症模型方法，其特征在于：所述培养细胞中，培养基为dmem/f12培养基，其包括90％培养基和10％胎牛血清。

3.根据权利要求1或2所述的构建绿脓菌素型奶牛乳腺上皮细胞炎症模型方法，其特征在于：所述培养细胞中，所述培养温度为37℃，co2浓度为5％。

4.根据权利要求1或2所述的构建绿脓菌素型奶牛乳腺上皮细胞炎症模型方法，其特征在于：所述培养细胞中，培养基与细胞数量比为2ml：1×104个。

5.根据权利要求1所述的构建绿脓菌素型奶牛乳腺上皮细胞炎症模型方法，其特征在于：所述细胞处理中，细胞培养至70％时进行绿脓菌素进行处理。

6.根据权利要求1所述构建绿脓菌素型奶牛乳腺上皮细胞炎症模型方法，其特征在于：所述细胞处理中绿脓菌素的处理浓度为0～5μg/ml。

7.根据权利要求1或6所述的构建绿脓菌素型奶牛乳腺上皮细胞炎症模型方法，其特征在于：所述细胞处理中绿脓菌素的处理浓度为1μg/ml。

8.根据权利要求1、4、5中任一所述的构建绿脓菌素型奶牛乳腺上皮细胞炎症模型方法，其特征在于：所述细胞处理中，绿脓菌素处理后的细胞相较相同条件lps处理的细胞具有更好的早期凋亡率和晚期凋亡率。

9.根据权利要求1、4、5中任一所述的构建绿脓菌素型奶牛乳腺上皮细胞炎症模型方法，其特征在于：所述细胞处理中，绿脓菌素处理后的细胞相较相同条件lps处理的细胞具有更高的il-1β、tnf-α表达量。

10.根据权利要求1、4、5中任一所述的构建绿脓菌素型奶牛乳腺上皮细胞炎症模型方法，其特征在于：所述细胞处理中，绿脓菌素处理后的细胞相较相同条件lps处理的细胞的p65荧光强度更高。

技术总结
本发明公开了一种构建绿脓菌素型奶牛乳腺上皮细胞炎症模型方法，其包括如下步骤：将奶牛乳腺上皮细胞培养后使用绿脓菌素对于培养细胞进行处理即可得到，本发明提供了一种绿脓菌素诱导奶牛乳腺上皮细胞炎症反应中的方法。本发明证明了绿脓菌素可诱导奶牛乳腺上皮细胞产生炎症反应，炎症模型构建成功。流式细胞仪检测细胞凋亡率升高、免疫因子的基因表达量增加，因而具有更高的可行性。

技术研发人员：徐天乐,朱浩,徐奕,杨章平
受保护的技术使用者：扬州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/8