一种枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌混合发酵培养的方法及应用与流程

本发明涉及生物发酵，具体涉及一种枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌混合发酵培养的方法及其应用。

背景技术：

1、枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种，为需氧型细菌，该菌无荚膜，有鞭毛，能活动，革兰氏染色呈阳性，芽孢位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大，是一种无致病性的安全微生物，在医药卫生食品等方面用途很广。丁酸梭菌是一种专性厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌，能够发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖等碳水化合物产酸。丁酸梭菌作为饲料添加剂在饲料中应用，对于减少当前饲料中抗生素产品的滥用、减少药物在肉品中的残留、降低动物细菌的耐药性和保障动物健康等方面具有重要意义。

2、枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌虽然在同时培养过程中由于对氧需求的差异性，导致培养难以实现，但是此种矛盾关系却为二者的协同作用提供了基础，目前，关于两者的共同培养主要集中在饲料等领域，而关于增加活菌数及增强抑菌效果的研究则并不多。

技术实现思路

1、发明人在研究中发现，采用特定的培养基在特定的条件下共同培养枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌，不仅可以显著提高活菌数，而且还可以增加其广谱性及对部分致病菌的抑制效果。

2、本发明的技术方案如下：一种枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌混合发酵培养的方法，发酵培养基包括以下重量百分比的原料：糖蜜1～3％，蔗糖1～2％，酵母浸粉1～2％，发酵豆粕0.5～1.0％，玉米淀粉0.8～1.2％，玉米浆1.2～1.7％，磷酸氢二钾0.03～0.07％，柠檬酸0.1～0.3％，磷酸氢二铵0.2～0.4％，乙酸钠0.3～0.7％，七水硫酸镁0.03～0.07％，四水氯化锰0.03～0.07％，碳酸钙0.08～0.12％；

3、发酵工艺为：初始发酵培养基ph为7.2±0.2，发酵过程中ph自然变化，37±2℃，45～55rpm搅拌速度，常压，培养30～48h。

4、作为一种优选的实施方式，所述发酵培养基由以下重量百分比的原料制备而成：糖蜜1～3％，蔗糖1～2％，酵母浸粉1～2％，发酵豆粕0.5～1.0％，玉米淀粉0.8～1.2％，玉米浆1.2～1.7％，磷酸氢二钾0.03～0.07％，柠檬酸0.1～0.3％，磷酸氢二铵0.2～0.4％，乙酸钠0.3～0.7％，七水硫酸镁0.03～0.07％，四水氯化锰0.03～0.07％，碳酸钙0.08～0.12％，余量为水。

5、优选的，所述发酵培养基由以下重量百分比的原料：糖蜜2％，蔗糖1.5％，酵母浸粉1.5％，发酵豆粕0.85％，玉米淀粉1％，玉米浆1.5％，磷酸氢二钾0.05％，柠檬酸0.2％，磷酸氢二铵0.3％，乙酸钠0.5％，七水硫酸镁0.05％，四水氯化锰0.05％，碳酸钙0.1％，余量为水。

6、优选的，枯草芽孢杆菌的种子液培养基包括以下重量百分比的原料：0.5～2％蛋白胨，0.25～1％酵母浸粉，0.5～2％氯化钠。丁酸梭菌的种子液培养基为：酵母浸粉0.3～1％、牛肉膏粉0.3～1％、蛋白胨0.5～2％、葡萄糖0.2～2.5％、可溶性淀粉0.01～0.3％、氯化钠0.1～2％、三水合乙酸钠0.1～0.7％、半胱氨酸盐酸盐0.01～0.1％，余量为水，调节ph至7.0后，每200ml加入碳酸钙0.05～0.15％并用10～20ml石蜡油液封。

7、作为一种优选的实施方式，丁酸梭菌与枯草芽孢杆菌的接种量之比为(1.5～2.5):1。

8、本发明的目的还在于保护一种枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌的混合菌剂，所述混合菌剂由上述发酵方法制备得到的发酵液制备而成。

9、作为一种优选的实施方式，所述混合菌剂的制备方法如下：将上述发酵液调节ph至5.0±0.2，之后加入稳定剂，混合均匀后，再与甘油按照体积比甘油：加入稳定包后的发酵液＝(2.5～3.5):2混合，即得。

10、作为一种优选的实施方式，所述稳定剂为氨基丁酸、氯化钠、明胶、海藻糖和壳聚糖，其添加量为终浓度分别为氨基丁酸0.1～3.5％、氯化钠1～3％、明胶0.5～4.5％、海藻糖0.35～3.5％、壳聚糖0.2～5％。

11、本发明的目的还在于保护上述发酵方法制备得到的发酵液、上述混合菌剂在抑制金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌、无乳链球菌、迟缓爱德华氏菌、弧菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌中的应用。

12、本发明通过采用特定的培养基及特定的发酵工艺对枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌进行混合发酵，最终制备得到的液体微生态制剂总菌数可达到100～300亿/ml，其中枯草芽孢菌杆菌的菌数可达到40～100亿/ml，丁酸梭菌的菌数可达到3～20亿/ml，并且还可以增加其广谱性及对部分致病菌的抑制效果，该菌剂可广范应用在各种饲养环境(畜牧、水产等)。

技术特征：

1.一种枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌混合发酵培养的方法，其特征在于，发酵培养基包括以下重量百分比的原料：糖蜜1～3％，蔗糖1～2％，酵母浸粉1～2％，发酵豆粕0.5～1.0％，玉米淀粉0.8～1.2％，玉米浆1.2～1.7％，磷酸氢二钾0.03～0.07％，柠檬酸0.1～0.3％，磷酸氢二铵0.2～0.4％，乙酸钠0.3～0.7％，七水硫酸镁0.03～0.07％，四水氯化锰0.03～0.07％，碳酸钙0.08～0.12％；

2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌混合发酵培养的方法，其特征在于，所述发酵培养基由以下重量百分比的原料制备而成：糖蜜1～3％，蔗糖1～2％，酵母浸粉1～2％，发酵豆粕0.5～1.0％，玉米淀粉0.8～1.2％，玉米浆1.2～1.7％，磷酸氢二钾0.03～0.07％，柠檬酸0.1～0.3％，磷酸氢二铵0.2～0.4％，乙酸钠0.3～0.7％，七水硫酸镁0.03～0.07％，四水氯化锰0.03～0.07％，碳酸钙0.08～0.12％，余量为水。

3.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌混合发酵培养的方法，其特征在于，所述发酵培养基由以下重量百分比的原料：糖蜜2％，蔗糖1.5％，酵母浸粉1.5％，发酵豆粕0.85％，玉米淀粉1％，玉米浆1.5％，磷酸氢二钾0.05％，柠檬酸0.2％，磷酸氢二铵0.3％，乙酸钠0.5％，七水硫酸镁0.05％，四水氯化锰0.05％，碳酸钙0.1％，余量为水。

4.根据权利要求1～3任一项所述的枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌混合发酵培养的方法，其特征在于，枯草芽孢杆菌的种子液培养基包括以下重量百分比的原料：0.5～2％蛋白胨，0.25～1％酵母浸粉，0.5～2％氯化钠。

5.根据权利要求1～3任一项所述的枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌混合发酵培养的方法，其特征在于，丁酸梭菌的种子液培养基为：酵母浸粉0.3～1％、牛肉膏粉0.3～1％、蛋白胨0.5～2％、葡萄糖0.2～2.5％、可溶性淀粉0.01～0.3％、氯化钠0.1～2％、三水合乙酸钠0.1～0.7％、半胱氨酸盐酸盐0.01～0.1％，余量为水，调节ph至7.0后，每200ml加入碳酸钙0.05～0.15％并用10～20ml石蜡油液封。

6.根据权利要求1～3任一项所述的枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌混合发酵培养的方法，其特征在于，丁酸梭菌与枯草芽孢杆菌的接种量之比为(1.5～2.5):1。

7.一种枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌的混合菌剂，其特征在于，所述混合菌剂由权利要求1～6任一项所述的发酵方法制备得到的发酵液制备而成。

8.根据权利要求7所述的枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌的混合菌剂，其特征在于，所述混合菌剂的制备方法如下：

9.根据权利要求8所述的枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌的混合菌剂，其特征在于，所述稳定剂为氨基丁酸、氯化钠、明胶、海藻糖和壳聚糖，其添加量为终浓度分别为氨基丁酸0.1～3.5％、氯化钠1～3％、明胶0.5～4.5％、海藻糖0.35～3.5％、壳聚糖0.2～5％。

10.权利要求1～6任一项所述的发酵方法制备得到的发酵液、权利要求7～9任一项所述的混合菌剂在抑制金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌、无乳链球菌、迟缓爱德华氏菌、弧菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌中的应用。

技术总结
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌混合发酵培养的方法及其应用。本发明采用包括以下重量百分比原料的培养基：糖蜜1～3％，蔗糖1～2％，酵母浸粉1～2％，发酵豆粕0.5～1.0％，玉米淀粉0.8～1.2％，玉米浆1.2～1.7％，磷酸氢二钾0.03～0.07％，柠檬酸0.1～0.3％，磷酸氢二铵0.2～0.4％，乙酸钠0.3～0.7％，七水硫酸镁0.03～0.07％，四水氯化锰0.03～0.07％，碳酸钙0.08～0.12％，在发酵工艺为：初始发酵培养基pH为7.2±0.2，发酵过程中pH自然变化，37±2℃，45～55rpm搅拌速度，常压的条件下对枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌进行混合发酵并制备成混合菌剂，不仅可以提高活菌数，而且还可以增加其广谱性及对部分菌的抑制效果。

技术研发人员：吴微,张茜茜,宁楠,詹泽涛,陶敏,李超,王启军,辜玲芳,邱权,张东晓,李洋
受保护的技术使用者：武汉新华扬生物股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15