一种检测厚垣镰刀菌的引物对及检测方法

本发明涉及病原菌检测，尤其涉及一种检测厚垣镰刀菌的引物对及检测方法。

背景技术：

1、草莓是一种多年生草本植物，原产于南美洲。它是广泛种植的杂交草莓的统称。草莓在世界各地大量栽培，已成为世界上栽培最广、产量最高的小浆果。草莓有着美丽的果实，宜人的香气和酸甜的味道，因此具有广泛的受众，拥有良好口碑。草莓富含糖类、有机酸、矿物质和维生素，维生素c含量高于日常水果。维生素c又称抗坏血酸，是植物界应用最广泛的抗氧化剂之一，在草莓等小浆果中含量丰富，因此小浆果也被认为是天然抗氧化剂最丰富的来源之一。

2、研究发现，草莓具有保健和药用价值，吃草莓可能对癌症、心血管疾病和一些慢性病有一定的预防作用。因为可食用的浆果含有抗氧化剂和花青素，草莓、蓝莓等浆果对人体健康和疾病预防都有有益作用。此外，浆果已被证明可以提高老年人的记忆力，草莓中的胺对治疗血液疾病有明显效果。草莓具有很高的经济价值，适应性强，耐温范围广，能耐受不同地区的气候和环境。近些年来，草莓种植业发展十分迅速，但同时连坐重茬造成的草莓根部病害逐年加重，尤其是草莓根腐病，很大程度上影响了草莓的品质和产量。引起草莓根腐病的病原菌种类繁多，主要的致病菌有镰孢属、疫霉属、炭疽菌属、丝核菌属、柱孢菌属等真菌。当前，草莓根腐病主要使用化学防治方式，相关农药品种繁多，但由于草莓根腐病的病原菌多样，且随着化学农药的频繁使用，加快了抗药性的产生，导致防治效果不佳。因此，更加准确的了解导致草莓根腐病的病原菌种类可以为草莓种植时可能发生的真菌病害的防治方式选择提供理论指导。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种检测厚垣镰刀菌的引物对及检测方法，特异性的检测厚垣镰刀菌，区别厚垣镰刀菌与其它病原真菌。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种检测厚垣镰刀菌的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物；

4、所述正向引物的核苷酸序列如seq id no.1所示；

5、所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.2所示。

6、本发明还提供了一种厚垣镰刀菌的检测方法，包括如下步骤：

7、(1)将菌种接种到pda培养基中，培养后观察气生菌丝生长状况、菌落颜色、培养基颜色、菌丝有无隔膜、孢子的颜色与形态及孢子的着生方式；

8、(2)将菌种扩大培养后分离出菌丝，将菌丝研磨后与bufferpcb混合，提取得到dna样品；

9、(3)用seq id no.1～2所示的引物对对dna进行pcr扩增，对扩增产物进行凝胶电泳，观察是否有明亮条带。

10、作为优选，步骤(1)中所述培养的温度为26～30℃，培养的时间为6～8d。

11、作为优选，步骤(2)中所述扩大培养的方法为：将菌种接种到pd水培养基的摇瓶中，在110～130rpm，26～30℃条件下培养6～8d。

12、作为优选，步骤(2)中所述菌丝和buffer pcb的用量比为10mg：55～65μl，所述bufferpcb的温度为63～67℃。

13、作为优选，步骤(2)中所述提取时采用ezup柱式植物基因组dna提取试剂盒。

14、作为优选，步骤(3)中所述扩增的反应体系为：taq pcr master mix24～26μl、dna样品4～6μl、正向引物1.8～2.2μl、反向引物1.8～2.2μl、双蒸水15～17μl，所述反应体系的总体积为50μl。

15、作为优选，步骤(3)中所述扩增的反应程序为：92～96℃预变性9～11min；92～96℃变性28～32s，53～57℃退火28～32s，70～74℃延伸55～65s，35个循环；70～74℃延伸9～11min。

16、作为优选，步骤(3)中所述凝胶电泳所用的凝胶为质量分数0.8～1.2％的琼脂糖凝胶。

17、作为优选，步骤(3)中所述凝胶电泳时的电压为4.5～5.5v/cm。

18、本发明提供了一种检测厚垣镰刀菌的引物对及检测方法，所述引物对包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.2所示。本发明的检测厚垣镰刀菌的引物对能够特异性的检测厚垣镰刀菌，区别厚垣镰刀菌与其它病原真菌。所用的检测方法简便，快速，准确性高，为草莓根腐病的病原真菌鉴定奠定了基础。

技术特征：

1.一种检测厚垣镰刀菌的引物对，其特征在于，所述引物对包括正向引物和反向引物；

2.一种厚垣镰刀菌的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述培养的温度为26～30℃，培养的时间为6～8d。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述扩大培养的方法为：将菌种接种到pd水培养基的摇瓶中，在110～130rpm，26～30℃条件下培养6～8d。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述菌丝和buffer pcb的用量比为10mg：55～65μl，所述buffer pcb的温度为63～67℃。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述提取时采用ezup柱式植物基因组dna提取试剂盒。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述扩增的反应体系为：taq pcr mastermix 24～26μl、dna样品4～6μl、正向引物1.8～2.2μl、反向引物1.8～2.2μl、双蒸水15～17μl，所述反应体系的总体积为50μl。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述扩增的反应程序为：92～96℃预变性9～11min；92～96℃变性28～32s，53～57℃退火28～32s，70～74℃延伸55～65s，35个循环；70～74℃延伸9～11min。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述凝胶电泳所用的凝胶为质量分数0.8～1.2％的琼脂糖凝胶。

10.根据权利要求2～9任意一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述凝胶电泳时的电压为4.5～5.5v/cm。

技术总结
本发明涉及病原菌检测技术领域。本发明提供了一种检测厚垣镰刀菌的引物对及检测方法，所述引物对包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的检测厚垣镰刀菌的引物对能够特异性的检测厚垣镰刀菌，区别厚垣镰刀菌与其它病原真菌。所用的检测方法简便，快速，准确性高，为草莓根腐病的病原真菌鉴定奠定了基础。

技术研发人员：王伟青,董杰,杨新建,田璐
受保护的技术使用者：北京农业职业学院（中国共产党北京市委员会农村工作委员会党校）
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15