一种甘草根尖干细胞的分离、培养方法与流程

本发明涉及植物细胞分离与培养的，尤其是涉及一种甘草根尖干细胞的分离、培养方法。

背景技术：

1、随着我国制药及功能性食品行业的迅速发展，市场对植物中活性成分的需求日益增长。植物中的活性成分具有抗衰老、提高免疫力及保护心脑血管等的作用，但其质量受环境因素和收获条件的影响，活性物质产量低。对于结构复杂、人工合成困难的活性成分，传统的愈伤组织培养方式虽然可以生产有价值的产品，但是经历脱分化的愈伤组织常常增加了细胞的异质性，对振荡培养的剪切力敏感，经多次有丝分裂后，容易产生dna甲基化以及转座子被激活等变异现象，导致细胞内部结构不稳定，天然产物的产量、性质不稳定等。

2、现有技术中，甘草细胞的培养多是利用愈伤组织进行培养产生次生代谢产物的，但由于愈伤组织细胞几乎由植物细胞脱分化而来，因此愈伤组织液泡化程度高，常常增加了细胞的异质性，并且愈伤组织对振荡培养的剪切力敏感，经多次有丝分裂后，容易产生dna甲基化以及转座子被激活等变异现象，导致培养过程不稳定，天然产物的产量、性质不稳定等缺点，难以适应现代工业生产需求。

3、植物干细胞具有旺盛的分裂能力和较高的遗传稳定性，由于其具有线粒体活性高、聚集度低、细胞壁无木质素沉积等特点，低温保藏后仍维持较高的细胞活性，在悬浮培养过程中对剪切力不敏感，能维持稳定的增殖速度，适合大规模的工业化生产。稳定、高产的甘草干细胞系对于次生代谢产物的研究非常关键，然而现有技术中关于甘草的干细胞培养却鲜有报道。

4、因此，如何对甘草的干细胞进行分离、培养，成为众多厂家所要解决的问题。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本申请提供一种甘草根尖干细胞的分离、培养方法。

2、本申请以光果甘草为试验材料，采用根尖切片的方法，用醋酸洋红染色观察根部结构，判断根尖干细胞的位置进行分离培养，根据细胞的生长速度与细胞染色鉴定，获得干细胞样细胞；同时对根尖干细胞的培养基进行优化，确定甘草干细胞的培养基配方。

3、第一方面，本申请提供一种甘草根尖干细胞的分离方法，采用如下的技术方案：一种甘草根尖干细胞的分离方法，步骤如下：将甘草幼苗根尖进行染色，鉴别甘草的根尖分生区，得到含有甘草干细胞的根尖分生区；

4、甘草的根尖分生区鉴别步骤如下：甘草根尖沿根部向上0-0.1mm处为根冠，在根冠沿根部向上0-0.6mm处，即为甘草的根尖分生区。

5、优选的，甘草幼苗根尖进行染色的步骤如下：用染料将甘草幼苗根尖进行染色，将甘草根尖剖开，用染料对根尖进行浸泡。

6、优选的，染料为醋酸洋红，醋酸洋红的体积浓度为0.2％-0.8％。

7、优选的，浸泡的时间为5-10min。

8、优选的，将鉴别得到的甘草根尖分生区在切削液中进行切割，得到含有干细胞的根尖分生区。

9、优选的，切削液包括以下质量浓度的原料：30-60mg/l的聚乙烯吡克烷酮、80-120mg/l抗坏血酸、120-180mg/l柠檬酸。

10、更优选的，切削液包括以下质量浓度的原料：50mg/l的聚乙烯吡克烷酮、100mg/l抗坏血酸、150mg/l柠檬酸。

11、第二方面，本申请提供一种甘草根尖干细胞的培养方法，采用如下的技术方案：

12、一种甘草根尖干细胞的培养方法，步骤如下：将上述方法分离得到的含有干细胞的根尖分生区放入至培养基中进行培养，得到干细胞样细胞。

13、优选的，培养基包括以下质量浓度的原料：3.0-5.0g/l ms培养基、20-50g/l蔗糖、6-8g/l植物凝胶、0.5-1.18mg/l 6-ba、0.5-1.44mg/l 2,4-d、0.2-1.44mg/l naa，ph值5.8-6.0。

14、优选的，培养的条件为：在25±1℃，转速为120rpm，黑暗条件下进行培养。

15、优选的，培养天数为10-15天。

16、第三方面，本申请提供一种干细胞样细胞，采用如下的技术方案：

17、一种干细胞样细胞，所述干细胞样细胞是将甘草根尖分离得到的含有干细胞的根尖分生区，经过培养后得到。

18、优选的，甘草根尖为甘草幼苗根尖。

19、在一个具体的可实施方案中，一种甘草根尖干细胞的分离、培养方法步骤如下：

20、1、甘草无菌苗培养；

21、2、甘草根尖干细胞分离培养与染色鉴定：

22、用体积浓度为0.2％-0.8％的醋酸洋红染料将甘草幼苗根尖进行染色，将甘草幼根从中部剖开，再使用体积浓度为0.2％-0.8％的醋酸洋红对根尖进行浸泡，浸泡约5-10min后，将根尖取出，放置在载玻片上进行制片观察；由于醋酸洋红是将染色体特异性染色，而干细胞具有较强的分裂能力，染色体的数量会比普通细胞中的多，因此在显微镜下可明显观察到具有明显显色反应的部位，而该部位则是甘草根尖分生区。

23、甘草根尖分生区的鉴别：按照前期的根尖分生区的染色分析可以清楚辨别出甘草根尖沿根部向上(即根部底端沿根部向上)0-0.1mm的长度为根冠位置，在根冠沿根部向上的0-0.6mm区间范围内则是甘草的根尖分生区，在甘草根尖分生区以上醋酸洋红颜色偏淡则是根部伸长区。

24、甘草根尖分生区的切割：对甘草的根尖分生区进行切割，得到含有干细胞的根尖分生区；为了防止植物根尖组织和细胞氧化死亡，该步骤在切削液中进行中进行。

25、3、甘草干细胞的培养

26、将切割后得到的含有干细胞的根尖分生区放到培养基中，在25±1℃，黑暗条件下进行培养10-15天，利用干细胞在增殖培养基增长速度快、具有抗逆性的特点即可将干细胞与普通细胞分离出来，并将培养后得到的干细胞定义为干细胞样细胞。

27、将生长速度快的细胞进行染色观察，普通甘草细胞只有一个液泡，而干细胞具有多个液泡结构，由此判断得到甘草干细胞即为干细胞样细胞。

28、本申请中通过显微观察甘草根尖分生区，对根尖干细胞进行分离培养，获取甘草干细胞样细胞，并对其培养基内植物激素的种类和浓度进行优化，可以获得甘草高产干细胞系。

29、综上所述，本申请包括以下至少一种有益技术效果：

30、1、本申请以甘草为试验材料，采用根尖切片的方法，用醋酸洋红染色观察根部结构，判断根尖干细胞的位置进行分离培养，并根据细胞的生长速度与细胞染色鉴定，获得甘草干细胞样细胞；

31、2、本申请中甘草根尖分生区染色定位准确，培养方法简单、易操作，在培养基下进行培养，干细胞样细胞生长速度较快。

技术特征：

1.一种甘草根尖干细胞的分离方法，其特征在于，步骤如下：将甘草幼苗根尖进行染色，鉴别甘草的根尖分生区，得到含有干细胞的根尖分生区；

2.根据权利要求1所述的一种甘草根尖干细胞的分离方法，其特征在于，甘草幼苗根尖染色的步骤如下：用染料将甘草幼苗根尖进行染色，将甘草根尖剖开，用染料对根尖进行浸泡。

3.根据权利要求2所述的一种甘草根尖干细胞的分离方法，其特征在于：染料为醋酸洋红，醋酸洋红的体积浓度为0.2%-0.8%。

4.根据权利要求2所述的一种甘草根尖干细胞的分离方法，其特征在于：浸泡的时间为5-10min。

5.根据权利要求1所述的一种甘草根尖干细胞的分离方法，其特征在于：将鉴别得到的甘草根尖分生区在切削液中进行切割，得到含有干细胞的根尖分生区。

6.根据权利要求5所述的一种甘草根尖干细胞的分离方法，其特征在于：切削液包括以下质量浓度的原料：30-60mg/l的聚乙烯吡克烷酮、80-120mg/l抗坏血酸、120-180mg/l柠檬酸。

7.一种甘草根尖干细胞的培养方法，其特征在于，步骤如下：将权利要求1-6中任一项所述方法分离得到的含有干细胞的根尖分生区放入至培养基中进行培养，得到干细胞样细胞。

8.根据权利要求7所述的一种甘草根尖干细胞的培养方法，其特征在于，培养基包括以下质量浓度的原料：3.0-5.0g/l ms培养基、20-50g/l蔗糖、6-8g/l植物凝胶、0.5-1.18mg/l6-ba、0.5-1.44mg/l 2,4-d、0.2-1.44mg/l naa，ph值5.8-6.0。

9.一种干细胞样细胞，其特征在于：所述干细胞样细胞是将甘草根尖分离得到的含有干细胞的根尖分生区，经过培养后得到。

10.根据权利要求9所述的一种干细胞样细胞，其特征在于：甘草根尖为甘草幼苗根尖。

技术总结
本发明涉及植物细胞分离与培养的技术领域，尤其是涉及一种甘草根尖干细胞的分离、培养方法；一种甘草根尖干细胞的分离与培养方法，步骤如下：用染料将甘草幼苗根尖进行染色，将甘草幼根剖开，用染料对根尖进行浸泡后，将根尖取出，鉴别甘草的根尖分生区，对甘草根尖分生区进行切割后，放入至培养基中进行培养，得到干细胞样细胞；本申请以甘草为试验材料，采用根尖切片的方法，用醋酸洋红染色观察根部结构，判断根尖干细胞的位置进行分离培养，根据细胞的生长速度与细胞染色鉴定，获得甘草干细胞样细胞，同时对干细胞的培养基进行优化，确定甘草干细胞的培养基配方，从而获得优化后的干细胞样细胞。

技术研发人员：谭国昇,王璐,赵永军,位明君,邵瞳,方晓霞,毛奎静
受保护的技术使用者：浙江觅得优生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15