作为标志物和治疗靶点的非编码RNA及其在制备ERA诊断产品中的应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一种作为标志物和治疗靶点的非编码rna及其在制备era诊断产品中的应用。

背景技术：

1、与附着点炎症相关关节炎(enthesitis-related arthritis, era)是幼年特发性关节炎(jia)临床亚型中的一个独特亚型。era早期无临床症状，随着病情进展，可累及脊柱和骶髂关节，引起炎性腰痛、背痛、脊柱僵直、活动困难，甚至并发眼、肾、肺病变，远期预后较差，可导致成人强直性脊柱炎，甚至致残。因此，早期诊断和治疗有利于控制疾病的发展，对改善预后具有重要意义。目前，era的诊断通常是基于体格检查及压痛、肿胀等症状，但体检检出率较低，临床表现不明显。因此，寻找era发病的分子标志物，并开发成早期诊断试剂盒，对于患儿无疑具有重要的临床意义和社会应用价值。

2、近年来，随着高通量测序技术的飞速发展，遗传物质的表达及调控正在不断被阐述。已有研究表明非编码rnas可在转录水平、转录后水平、表观遗传水平调控基因表达，与疾病的发生发展有着密切关系。更为耀眼的是，近两年随着新冠核酸检测试剂盒及ctdna检测在临床上的广泛应用，与传统的蛋白或代谢物检测相比较，核酸检测（包括dna和rna）在疾病诊断中已经体现出尤为卓越的优势：组织特异性强、灵敏度高、检测方法成熟简便、假阳性率低、可重复性强、普及率高等特点。

3、大量研究证实，体液中存在大量的核酸片段，包括双链游离cfdna、小非编码rna（small non-coding rna，sncrna）等，有可能为疾病诊断和预后提供新的生物标志物，并已开展数项临床研究进一步论证核酸片段在疾病诊断中的应用价值。井喷般的证据表明，非编码rna在多种疾病及肿瘤组织/体液中具有显著差异表达、高稳定性的特征，提示极有可能成为疾病诊断的新指标。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供非编码rna（trf-21-lnk8kep1b）作为标志物和治疗靶点在制备era诊断产品中的应用，为临床早期诊断era提供参考。

2、本发明的技术方案如下：

3、在本发明的第一方面，提供了一种作为era诊断标志物和治疗靶点的非编码rna（trf-21-lnk8kep1b），所述非编码rna片段的核苷酸序列如seq id no：1所示，具体核苷酸序列为cgauucccggccaaugcacca。

4、在本发明的第二方面，提供了如第一方面所述的非编码rna在制备era诊断产品中的应用。所述的诊断产品通过检测era患者的编码rna的表达，从而能够实现era的早期诊断。

5、在本发明的第三方面，提供了检测如第一方面所述的非编码rna（trf-21-lnk8kep1b）表达的试剂在制备era诊断产品中的应用。诊断试剂可以通过检测被试者血清中非编码rna（trf-21-lnk8kep1b）的表达，与健康对照组相比较特异性升高，以此来判断被试者的era患病风险。

6、进一步地，所述试剂包括利用sybr green检测所述如第一方面所述的非编码rna表达量时使用的pcr扩增引物。

7、进一步地，所述的pcr扩增引物的核苷酸序列如seq id no：6和seq id no：7所示。

8、进一步地，所述产品包括试剂盒、芯片或试纸。

9、在本发明的第四方面，提供了一种用于era诊断的试剂盒，所述的试剂盒包含用于检测血清中核苷酸序列如seq id no：1所示的非编码rna片段（trf-21-lnk8kep1b）表达水平的检测试剂。

10、进一步地，所述的检测试剂包括：1）逆转录的反应试剂和基因特异性反向引物；2）pcr反应试剂和pcr扩增引物。逆转录试剂和pcr反应试剂均为商业购买的现有试剂。例如逆转录试剂可以采用riboscripttm reverse transcription kit。pcr反应试剂可以采用chamq sybr qpcr master mix(vazyme，nanjing，china)试剂盒。

11、进一步地，所述的基因特异性反向引物的核苷酸序列如seq id no：5所示。

12、进一步地，所述的pcr扩增引物的核苷酸序列如seq id no：6和seq id no：7所示。

13、本发明的发明构思如下：本发明的非编码rna（trf-21-lnk8kep1b）来源于era患儿。在前期研究中，分离提取era患儿及正常儿童的血清中rna并进行去修饰预处理后，通过高通量测序技术，发明人发现：

14、1）era患儿血清中trf-21-lnk8kep1b较正常儿童明显升高具有独特的rna表达谱。

15、2）通过qrt-pcr实验验证发现（era 30例 vs hcs 31例），trf-21-lnk8kep1b在患儿血清中的表达水平与健康对照人群相比显著高表达。

16、3）通过构建roc曲线，证明了trf-21-lnk8kep1b在诊断era中具有极高的灵敏性与特异性，同时通过对照治疗前与治疗后患儿血清中trf-21-lnk8kep1b的表达量，发现在新发患儿中明显高表达，证明其对早期诊断具有极大价值。

17、因此有充分的理由相信：trf-21-lnk8kep1b极有可能是era诊断尤其是早期诊断的分子标志物。可基于trf-21-lnk8kep1b为靶点，制备诊断era的试剂盒。

18、本发明的技术效果如下：本发明的多个实施例证明，非诊断rna（trf-21-lnk8kep1b）不仅具备目前核酸分子用于临床诊断的技术优势，而且稳定性高、显著提高诊断的准确率，提示trf-21-lnk8kep1b极有可能成为临床疾病早期诊断划时代的新指标，trf-21-lnk8kep1b的诸多优点可能为临床疾病的新药研制提供依据。

技术特征：

1.一种作为era诊断标志物和治疗靶点的非编码rna，其特征在于，所述非编码rna片段的核苷酸序列如seq id no：1所示。

2.如权利要求1所述的非编码rna在制备era诊断产品中的应用。

3.检测非编码rna表达的试剂在制备era诊断产品中的应用，所述非编码rna片段的核苷酸序列如seq id no：1所示。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂包括利用sybr green检测所述非编码rna表达量时使用的pcr扩增引物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的pcr扩增引物的核苷酸序列如seqid no：6和seq id no：7所示。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述诊断产品包括试剂盒、芯片或试纸。

7.一种用于era诊断的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含用于检测血清中核苷酸序列如seq id no：1所示的非编码rna片段表达水平的检测试剂。

8.根据权利要求7所述的用于era诊断的试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂包括：1）逆转录的反应试剂和基因特异性反向引物；2）pcr反应试剂和pcr扩增引物。

9.根据权利要求8所述的用于era诊断的试剂盒，其特征在于，所述的基因特异性反向引物的核苷酸序列如seq id no：5所示。

10.根据权利要求8所述的用于era诊断的试剂盒，其特征在于，所述的pcr扩增引物的核苷酸序列如seq id no：6和seq id no：7所示。

技术总结
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种作为标志物和治疗靶点的非编码RNA及其在制备ERA诊断产品中的应用。本发明提供了一种作为ERA诊断标志物和治疗靶点的非编码RNA及其应用，所述非编码RNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还提供了用于检测所述非编码RNA表达的试剂在制备ERA诊断产品中的应用。本发明的多个实施例证明，非诊断RNA（tRF‑21‑LNK8KEP1B）不仅具备目前核酸分子用于临床诊断的技术优势，而且稳定性高、显著提高诊断的准确率，提示tRF‑21‑LNK8KEP1B极有可能成为临床疾病早期诊断划时代的新指标，tRF‑21‑LNK8KEP1B的诸多优点可能为临床疾病的新药研制提供依据。

技术研发人员：俞海国,樊志丹,王攀攀
受保护的技术使用者：南京市儿童医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15