一种同时检测多种病原体的靶向检测试剂盒及其制备方法与应用与流程

本发明属于靶向宏基因组检测(tngs)领域，具体公开了一种同时检测多种病原体的靶向检测试剂盒及其制备方法与应用。

背景技术：

1、感染(infection)是指细菌、病毒、真菌、寄生虫等病原体侵入人体所引起的局部组织和全身性炎症反应。由于感染引起的疾病称为感染性疾病，部分具有传染性。机体各个器官、组织、系统均可有感染情况发生，且不同器官系统的感染性疾病，其临床表现可存在一定差异。通常医生会根据临床表现进行经验性用药，根据治疗效果以及获得感染的病原体类型后再进行药物类型、剂量调整。造成人类感染性疾病的病原体日益复杂、种类增多，病原体不明确导致抗菌药物滥用进而致使细菌耐药，病原微生物已成为全球关注的焦点。据who统计，2019年，全球5540万死亡病例中，10大死因占55％。其中下呼吸道感染是世界上最致命的传染病，排在主要死亡原因的第四位，2019年死亡人数为260万人。

2、病原体快速准确的检测和鉴定是感染治疗的首要问题。随着生物学研究由宏观领域向微观领域的发展，病原体检测方法也从组织形态学水平深入到分子水平、基因水平。在过去，检测病原更多地依赖培养、镜检、生化指标等经典检测技术，或者质谱、荧光定量pcr等分子检测技术，这些检测技术需要经验积累，还存在分辨率不足、时效性不够、通量有限、无法检测未知病原等缺点。最近几年，随着技术发展，病原宏基因组检测技术(metagenomics next generation sequencing，简称mngs)在临床病原检测、院感监测、流调等方面的应用越来越成熟，无需预设，无需培养，无偏好性，直接提取临床样本中的dna/rna，进行二代高通量测序，经过专用病原数据库比对与生信分析，一次性完成细菌、病毒、真菌、寄生虫等病原体的检测。新型冠状病毒sar-cov2由mngs首次检出，使之声名鹊起。mngs检测优势巨大，也有明显的缺点，比如报告解读困难和检测灵敏度不足。前者是因为检出非常多微生物，难以明确主要致病病原体。后者是因为临床样本中大多数数据是人的序列，导致其检测灵敏度不足。

技术实现思路

1、针对现有技术不足，本文公开了一种同时检测多种病原体的靶向检测试剂盒，仅需微量基因组dna，通过多重pcr反应，然后再利用样本中不同微生物核酸不同，即可快速完成病原体鉴定。

2、本发明包括以下技术方案：

3、一种同时检测多种病原体的靶向检测试剂盒，包括样本处理液，2×多重逆转录pcr反应液、逆转录pcr酶混合液、逆转录引物混合液；多重pcr特异性引物混合液、无rna酶水、阳性对照。

4、进一步的，上述一种同时检测多种病原体的靶向检测试剂盒，所述病原体包括甲流病毒、乙流病毒、合胞病毒和新冠病毒四大类病毒。

5、进一步的，上述一种同时检测多种病原体的靶向检测试剂盒，所述多重pcr特异性引物包括以下四组多重pcr引物对，是分别针对甲流病毒、乙流病毒、合胞病毒和新冠病毒四大类病毒的相对通用引物。

6、进一步的，上述一种同时检测多种病原体的靶向检测试剂盒，所述多重pcr特异性引物包括以下引物对：

7、针对甲流病毒的引物对包括：

8、甲f引物＝seq id no：1＝agacctattcccctcctctaac；

9、甲r引物＝seq id no：2＝aggcatcacttcattcattc；

10、针对乙流病毒的引物对包括：

11、乙f引物＝seq id no：3＝taactgacttcttactaccc；

12、乙r引物＝seq id no：4＝ttacacttctaggctcctta；

13、针对合胞病毒的引物对包括：

14、合f引物＝seq id no：5＝aacctctacttcctatca；

15、合r引物＝seq id no：6＝catcggcatcagttcttacc；

16、针对新冠病毒的引物对包括：

17、新f引物＝seq id no：7＝ggtattcatctacgtactg；

18、新r引物＝seq id no：8＝actccgtagcctcagctcta。

19、进一步的，本发明公开了一种同时检测多种病原体的靶向检测方法，所述方法中使用上述的靶向检测试剂盒。

20、进一步的，上述同时检测多种病原体的靶向检测方法，包括以下步骤：

21、(1)收集样品，使用样本处理液处理样品；

22、(3)以提取的总核酸为模板进行反转录；

23、(4)建立rt和多重pcr反应体系，将引物以及各反应组份置于pcr仪中，加入被检样品提取的dna模板或反转录产物，进行扩增；

24、(6)进行测序，将测序得到的数据，进行生物信息分析，得到样本的病原类型。

25、进一步的，上述同时检测多种病原体的靶向检测方法，所述步骤(1)中，样品处理后其中核酸浓度不少于5ng/ul，a260/a280：1.7-2.0。

26、进一步的，上述同时检测多种病原体的靶向检测方法，所述样本处理液为0.2m的磷酸盐缓冲液。

27、进一步的，上述同时检测多种病原体的靶向检测方法，所述测序为二代高通量测序。

28、进一步的，本发明还公开了上述靶向检测试剂盒在靶向宏基因组检测中的应用。

29、本发明具有以下有益效果：

30、本发明公开了一种病原体靶向检测试剂盒，使用靶向宏基因组检测，argetednext generation sequencing，简称tngs，针对常见的呼吸道病毒进行检测。

31、仅需微量基因组dna，通过多重pcr反应，然后再利用样本中不同微生物核酸不同，即可快速完成病原体鉴定。通过高通量测序，再对测序结果进行分析判读，最终得出检测样本的病原体鉴定结果，从而为患者的诊疗提供指导。一次检测就可以快速了解感染原因。同时本试剂盒操作简便，耗时短，极易实现自动化检测。

32、本试剂盒用于定性检测病原体鉴定结果，仅需一步pcr反应，即可对几十上百个临床关注的病原体进行同步检测，整体实验周期短：一天内可完成从dna到结果输出；操作灵活：无需凑样，可根据需求灵活增减位点；流程简单、自动化：实验简单，搭配数据分析系统，自动输出检测结果。

技术特征：

1.一种同时检测多种病原体的靶向检测试剂盒，其特征在于，包括，样本处理液，2×多重逆转录pcr反应液、逆转录pcr酶混合液、逆转录引物混合液；多重pcr特异性引物混合液、无rna酶水、阳性对照。

2.根据权利要求1所述的一种同时检测多种病原体的靶向检测试剂盒，其特征在于，所述病原体包括甲流病毒、乙流病毒、合胞病毒和新冠病毒四大类病毒。

3.根据权利要求1所述的一种同时检测多种病原体的靶向检测试剂盒，其特征在于，所述多重pcr特异性引物包括以下四组多重pcr引物对，是分别针对甲流病毒、乙流病毒、合胞病毒和新冠病毒四大类病毒的相对通用引物。

4.根据权利要求3所述的一种同时检测多种病原体的靶向检测试剂盒，其特征在于，所述多重pcr特异性引物包括以下引物对：

5.一种同时检测多种病原体的靶向检测方法，其特征在于，使用如权利要求1-4任一项所述的靶向检测试剂盒。

6.根据权利要求5所述的一种同时检测多种病原体的靶向检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的一种同时检测多种病原体的靶向检测方法，其特征在于，所述步骤（1）中，样品处理后其中核酸浓度不少于5ng/ul，a260/a280：1.7-2.0。

8.根据权利要求6所述的一种同时检测多种病原体的靶向检测方法，其特征在于，所述样本处理液为0.2m的磷酸盐缓冲液。

9.根据权利要求6所述的一种同时检测多种病原体的靶向检测方法，其特征在于，所述测序为二代高通量测序。

10.如权利要求1-4任一项所述的靶向检测试剂盒在靶向宏基因组检测中的应用。

技术总结
本发明属于靶向宏基因组检测（tNGS）领域，具体公开了一种同时检测多种病原体的靶向检测试剂盒及其制备方法与应用。本发明公开的检测试剂盒仅需微量基因组DNA，通过多重PCR反应，然后再利用样本中不同微生物核酸不同，即可快速完成病原体鉴定；通过高通量测序，再对测序结果进行分析判读，最终得出检测样本的病原体鉴定结果，从而为患者的诊疗提供指导。一次检测就可以快速了解感染原因。同时本试剂盒操作简便，耗时短，极易实现自动化检测。

技术研发人员：范婷婷,张雪英,张文锐
受保护的技术使用者：南京艾迪康医学检验所有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15