一种T7RNA聚合酶的制备方法及其在体外合成dsRNA中的应用

本发明涉及生物防治，特别涉及一种t7 rna聚合酶的制备方法及其在体外合成dsrna中的应用。

背景技术：

1、在植物保护领域中，随着rna干扰(rna interference，rnai)的兴起和发展，基于rnai的抗虫技术成为新型绿色无公害的害虫防控方法，它以害虫生长发育或重要行为过程中特异性的关键基因为靶标，利用人工合成的双链rna(double-strand rna，dsrna)抑制或沉默这些关键基因的表达，通过影响害虫的发育和繁殖，达到害虫防控的效果。rnai抗虫技术对人畜无毒性，不伤害天敌，不破坏生态环境，是理想的害虫防控方法，而且利用人工合成的dsrna饲喂害虫，相比于表达dsrna的转基因作物的生物安全性更高，具有巨大的应用前景。

2、人工体外合成rna主要包括化学合成和酶法合成两种方法。化学合成法合成价格昂贵、程序复杂，而且随着合成长度的增加，其生产成本会急剧上升，因此常适用于100个核苷酸以下的短链rna的合成，使得应用范围受到较大限制。利用t7 rna聚合酶体外酶法合成特异性rna是当前主要方法。来源于t7噬菌体表达的单亚基rna聚合酶由于具有结构简单、转录高效、延伸能力强等优点，且严格、特异识别t7启动子，被广泛用于体外制备rna。市面上已有多家公司上市了多款以t7 rna聚合酶为合成酶的rna体外合成专用试剂盒，如takara rna体外转录试剂盒、新海基因t7高产rna合成试剂盒等。

3、目前，t7 rna聚合酶的生物制备多是通过原核表达系统体内诱导表达如利用大肠杆菌作为宿主菌重组表达、再通过破菌纯化得到。然而体内诱导表达得到的t7 rna聚合酶需要经过繁琐的纯化过程，一方面会影响纯化所得的酶活性，另一方面将导致制备成本随之升高，这也是市面上相应的rna体外合成试剂盒价格都较高的原因，由此大大限制了t7rna聚合酶体外合成特异性rna的应用，特别是对于体外合成dsrna用于rnai防治植物病虫害中的应用。

技术实现思路

1、针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种t7 rna聚合酶的制备方法，并提供了该方法在体外合成dsrna中的应用，以及合成得到的dsrna在害虫防治中的应用，本发明通过sfgfp与t7 rna聚合酶融合表达，可将部分t7 rna聚合酶定位在宿主菌外膜上，通过tes缓冲液洗脱即可得到较纯且具有活性的t7 rna聚合酶，利用洗脱下来的t7 rna聚合酶，可直接合成dsrna，应用于植物病虫害的防治。

2、本发明具体通过以下技术方案实现：

3、本发明的第一方面提供了一种t7 rna聚合酶的制备方法，包括以下步骤：

4、s11、构建sfgfp和t7 rna聚合酶融合表达的表达载体，所述sfgfp位于所述t7 rna聚合酶的上游；

5、s12、将所述表达载体转入宿主菌中，得到转化子，培养所述转化子并诱导融合蛋白表达，所述融合蛋白包括所述sfgfp和所述t7 rna聚合酶；

6、s13、收集所述转化子，加入tes缓冲液混匀并静置，之后4000-8000rpm离心3-10min，收集上清液，得到含t7 rna聚合酶的溶液。

7、进一步地，所述sfgfp与所述t7 rna聚合酶之间设有3c蛋白酶酶切位点。

8、进一步地，所述sfgfp的上游设有组氨酸标签。

9、进一步地，所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

10、更进一步地，所述融合蛋白的基因序列如seq id no.2所示。

11、进一步地，步骤s11中，所述表达载体为pet23a载体，所述表达载体的构建过程包括以下步骤：

12、s111、通过pcr分别扩增sfgfp基因和t7 rna聚合酶基因，扩增所述sfgfp基因的引物对的序列如seq id no.3-4所示，扩增所述t7 rna聚合酶基因的引物对的序列如seq idno.5-6所示；

13、s112、利用无缝克隆技术将所述t7 rna聚合酶基因和所述sfgfp基因整合到所述pet23a载体中，构建得到所述表达载体。

14、进一步地，步骤s13中，通过离心收集所述转化子，加入tes缓冲液混匀并静置10min，之后4℃、6000rpm离心6min，收集上清液，得到含t7 rna聚合酶的溶液。

15、本发明的第二方面提供了如上所述的t7 rna聚合酶的制备方法制备得到的t7rna聚合酶在体外合成dsrna中的应用。

16、本发明的第三方面提供了一种体外合成dsrna的方法，包括以下步骤：将含有t7启动子序列的模板、ntp、t7 rna聚合酶和聚合酶缓冲溶液混合均匀，得到反应体系，孵育反应，反应完成后分离纯化，得到dsrna；其中，所述t7 rna聚合酶由如上所述的t7 rna聚合酶的制备方法制备得到。

17、进一步地，所述模板包括柳蓝叶甲actin基因或茄二十八星瓢虫srp54k基因，所述柳蓝叶甲actin基因的序列如seq id no.7所示，所述茄二十八星瓢虫srp54k基因的序列如seq id no.8所示。

18、进一步地，孵育反应包括：将反应体系在37-42℃反应4-10h，之后70℃孵育10min，自然冷却至室温。

19、本发明的优点及积极效果为：

20、本发明通过将sfgfp与t7 rna聚合酶形成融合蛋白进行原核表达，可以高效率诱导表达获得目标融合蛋白，而且利用sfgfp超折叠可将t7 rna聚合酶部分展示到细胞外膜，由此可仅通过tes缓冲液洗脱细胞外膜，即可获得纯度较高且具有活性的t7 rna聚合酶，极大简化了t7 rna聚合酶的制备过程，大大降低了制备t7 rna聚合酶的时间与成本；同时，制备的t7 rna聚合酶具有高生物活性，能合成靶向不同基因的dsrna，并对不同害虫都有良好的抗虫效果。

技术特征：

1.一种t7 rna聚合酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的t7 rna聚合酶的制备方法，其特征在于，所述sfgfp与所述t7rna聚合酶之间设有3c蛋白酶酶切位点。

3.根据权利要求1所述的t7 rna聚合酶的制备方法，其特征在于，所述sfgfp的上游设有组氨酸标签。

4.根据权利要求1所述的t7 rna聚合酶的制备方法，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示，基因序列如seq id no.2所示。

5.根据权利要求1所述的t7 rna聚合酶的制备方法，其特征在于，步骤s11中，所述表达载体为pet23a载体，所述表达载体的构建过程包括以下步骤：

6.根据权利要求1所述的t7 rna聚合酶的制备方法，其特征在于，步骤s13中，通过离心收集所述转化子，加入tes缓冲液混匀并静置10min，之后4℃、6000rpm离心6min，收集上清液，得到含t7 rna聚合酶的溶液。

7.如权利要求1-6任一项所述的t7 rna聚合酶的制备方法制备得到的t7 rna聚合酶在体外合成dsrna中的应用。

8.一种体外合成dsrna的方法，其特征在于，包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的体外合成dsrna的方法，其特征在于，所述模板包括柳蓝叶甲actin基因或茄二十八星瓢虫srp54k基因；所述柳蓝叶甲actin基因的序列如seq id no.7所示，所述茄二十八星瓢虫srp54k基因的序列如seq id no.8所示。

10.根据权利要求8所述的体外合成dsrna的方法，其特征在于，孵育反应包括：将反应体系在37-42℃反应4-10h，之后70℃孵育10min，自然冷却至室温。

技术总结
本发明属于生物防治技术领域，尤其涉及一种T7RNA聚合酶的制备方法及其应用。制备方法包括：S11、构建sfGFP和T7RNA聚合酶融合表达的表达载体，sfGFP位于T7RNA聚合酶的上游；S12、将表达载体转入宿主菌中，培养转化子并诱导融合蛋白表达；S13、收集转化子，加入TES缓冲液混匀并静置，之后4000‑8000rpm离心3‑10min，收集上清液，得到含T7RNA聚合酶的溶液。本发明通过sfGFP与T7RNA聚合酶融合表达，可将部分T7RNA聚合酶定位在宿主菌外膜上，通过TES缓冲液洗脱即可得到较纯且具有活性的T7RNA聚合酶，极大简化了酶的制备过程，显著降低了成本。

技术研发人员：杨升,张江,谢蒙蒙,于赛赛,李圣纯
受保护的技术使用者：湖北大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15