青霉ZJUT23及其在制备吡喃酮类化合物中的应用

(一)本发明涉及微生物，具体涉及一株青霉菌及其在制备γ-吡喃酮类化合物中的应用，有助于解决高纯度γ-吡喃酮类化合物的规模化制备这一难题。

背景技术：

0、(二)背景技术

1、streptopyrone是由链霉菌产生的一种γ-吡喃酮类次级代谢产物，分子式为c7h10o4,相对分子质量158，易溶于甲醇、二氯甲烷等有机溶剂，其化学结构如式(i)所示：

2、

3、streptopyrone是一种强效的微管蛋白聚集抑制剂和有丝分裂抑制剂，可作为探针分子用于研究微管蛋白的聚合过程及其详细机制，在生命科学领域有着重要的应用前景。然而，截至目前，仅有文献报道少数链霉菌可产生streptopyrone，尚无该化合物的规模化制备方法报道。从真菌中筛选streptopyrone高产菌株，并开发经济、便捷的微生物发酵工艺，对于高纯度streptopyrone的规模化制备具有重要意义。

技术实现思路

0、(三)
技术实现要素：

1、本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷，另辟蹊径，提供一株新菌株——青霉zjut23及其在制备γ-吡喃酮类化合物中的应用，本发明以特殊生境真菌——青霉菌为筛选对象，经过大量的创造性实验，筛选得到青霉zjut23，通过菌株的发酵培养和发酵产物的提取分离，以高产率获得高纯度γ-吡喃酮类化合物(ⅰ)，解决了现有的技术缺陷。

2、为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案是：

3、本发明提供一株高产高纯度γ-吡喃酮类化合物(ⅰ)的新菌株--青霉(penicillium sp.)zjut23，分离于玛索海沟来源的海泥样品，该菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2023年4月6日，保藏编号为cctcc no:m2023475，地址为中国，武汉，武汉大学。

4、本发明还提供了一种所述青霉zjut23在制γ-吡喃酮类化合物(ⅰ)中的应用，所述应用的方法为：(1)将青霉zjut23接种至发酵培养基，28℃,180rpm在震荡培养箱中培养7天，再静置培养7天，获得发酵液；所述发酵培养基组成：酵母提取物2g/l、mgso4·7h2o0.5g/l，葡萄糖15g/l，微量元素溶液0.1ml/l，溶剂蒸馏水；微量元素溶液组成：znso4·7h2o1.0g/ml，cuso4·5h2o 0.5g/ml，溶剂蒸馏水；(2)将发酵液以有机溶剂萃取，收集有机相，减压浓缩至干，得到萃取物浸膏；(3)将步骤(2)萃取物浸膏进行mci chp20p柱层析，以体积比20:80～100:0的甲醇/水混合溶剂为洗脱液进行梯度洗脱，收集体积比20:80的甲醇/水洗脱部位，减压浓缩至干，得浓缩物；(4)将步骤(3)所得浓缩物进行硅胶柱层析，以体积比5:1～1:1的石油醚/丙酮混合溶剂为洗脱液进行梯度洗脱，收集体积比为5:1的石油醚/丙酮洗脱部位，减压浓缩至干，即得到式(ⅰ)所示γ-吡喃酮类化合物；

5、

6、优选的，步骤(1)所述青霉zjut23接种至发酵培养基前，先进行活化培养，再将活化后的菌悬液以体积分数0.1～1％的接种量接种号液体培养基，所述活化是指将青霉zjut23接种至马铃薯葡萄糖琼脂(pda)培养基，28℃培养，使菌株活化，将活化后的菌株用含体积浓度2％吐温80的无菌水重悬，得到菌悬液；所述菌悬液中菌体浓度为1×105～1×108个/ml，优选1×106个/ml；所述pda培养基组成为：马铃薯200g/l、葡萄糖20g/l、琼脂18g/l，溶剂为蒸馏水，ph自然。

7、优选的，步骤(2)所述有机溶剂为乙酸乙酯，每次萃取所用有机溶剂与发酵液的体积比为0.05-0.5:1，优选0.07:1；萃取3～5次。

8、优选的，步骤(3)方法为：萃取物浸膏以甲醇溶解后进行mci chp20p柱层析，依次以体积比为20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10和100:0的甲醇/水混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱2～5个(优选2个)柱体积，流速均为10～20ml/min(优选15ml/min)；收集体积比20:80的甲醇-水洗脱部位，减压浓缩至干，得浓缩物。

9、优选的，将步骤(4)所得浓缩物进行硅胶柱层析，以体积比为5:1～1:1的石油醚/丙酮混合溶剂为洗脱液进行梯度洗脱，每一梯度洗脱2～5个(优选2个)柱体积，流速均为10～20ml/min(优选15ml/min)，收集体积比5:1的石油醚/丙酮洗脱部位，减压浓缩至干，得到式(ⅰ)所示γ-吡喃酮类化合物。

10、与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

11、本发明提供一种经多年实验筛选获得的保藏编号为cctcc no：m 2023475的青霉zjut23，并首次报道了利用该菌株发酵培养，高产率(40mg/l)制备高纯度streptopyrone的方法，纯度达到99％；该制备方法具有发酵条件简单、菌种易培养、工艺步骤少、生产周期短等优势，具有工业化、规模化生产的潜力。本方法对于解决高纯度streptopyrone标准品或对照品的规模化制备这一问题具有重要意义。

技术特征：

1.青霉(penicillium sp.)zjut23，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2023年4月6日，保藏编号为cctcc no：m2023475，地址为中国，武汉，武汉大学。

2.一种权利要求1所述青霉zjut23在发酵制备吡喃酮类化合物中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述吡喃酮类化合物按如下步骤制备：(1)将青霉zjut23接种至发酵培养基，28℃,180rpm在震荡培养箱中培养7天，再静置培养7天，获得发酵液；所述发酵培养基组成为：酵母提取物2g/l、mgso4·7h2o 0.5g/l，葡萄糖15g/l，微量元素溶液0.1ml/l，溶剂蒸馏水；微量元素溶液组成：znso4·7h2o 1.0g/ml，cuso4·5h2o0.5g/ml，溶剂蒸馏水；(2)将发酵液以有机溶剂萃取，收集有机相，减压浓缩至干，得到萃取物浸膏；(3)将步骤(2)萃取物浸膏进行mci chp20p柱层析，以体积比20:80～100:0的甲醇/水混合溶剂为洗脱液进行梯度洗脱，收集体积比20:80的甲醇/水洗脱部位，减压浓缩至干，得浓缩物；(4)将步骤(3)所得浓缩物进行硅胶柱层析，以体积比5:1～1:1的石油醚/丙酮混合溶剂为洗脱液进行梯度洗脱，收集体积比为5:1的石油醚/丙酮洗脱部位，减压浓缩至干，即得到式(ⅰ)所示γ-吡喃酮类化合物；

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述青霉zjut23接种至发酵培养基前，先进行活化培养，再将活化后的菌悬液以体积分数0.1～1％的接种量接种发酵培养基，所述活化是指将青霉zjut23接种至pda培养基，置28℃培养，使菌株活化，将活化后的菌株用含体积浓度2％吐温80的无菌水重悬，得到菌悬液；所述菌悬液中菌体浓度为1×105～1×108个/ml；所述pda培养基组成为：马铃薯200g/l、葡萄糖20g/l、琼脂18g/l，溶剂为蒸馏水，ph自然。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)中所述有机溶剂为乙酸乙酯，每次萃取所用有机溶剂与发酵液的体积比为0.05-0.5:1；萃取3～5次。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(3)方法为：萃取物浸膏以甲醇溶解后进行mci chp20p柱层析，依次以体积比为20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10和100:0的甲醇/水混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱2～5个柱体积，流速均为10～20ml/min；收集体积比20:80的甲醇/水洗脱部位，减压浓缩至干，得浓缩物。

7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，将步骤(4)所得浓缩物进行硅胶柱层析，以体积比为5:1～1:1的石油醚/丙酮混合溶剂为洗脱液进行梯度洗脱，每一梯度洗脱2～5个柱体积，流速为10～20ml/min，收集体积比5:1的石油醚/丙酮洗脱部位，减压浓缩至干，得到式(ⅰ)所示γ-吡喃酮类化合物。

技术总结
本发明公开一种青霉ZJUT23及其在发酵制备吡喃酮类化合物中的应用。本发明首次报道了利用该菌株发酵培养，高产率制备高纯度streptopyrone的方法，纯度达到99％；该制备方法具有发酵条件简单、菌种易培养、工艺步骤少、生产周期短等优势，具有工业化、规模化生产的潜力。本方法对于制备高纯度streptopyrone标准品或对照品具有重要意义。

技术研发人员：应优敏,倪嘉悦,雷潘懿
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/8