一种用于同时检测miRNA和信使RNA的刚性四边形DNA生物传感器的构建及应用

本发明属于分析化学检测，具体涉及一种用于同时检测mirna和信使rna的刚性四边形dna生物传感器的构建及应用。

背景技术：

1、肿瘤的转移性表现为上皮细胞转化为间充质细胞的特性，间充质细胞具有迁移和侵袭能力。因此，同时检测转移性肿瘤细胞中的多种标志物对于准确了解癌症的进展具有重要意义。

2、mirna-10b高表达与多种肿瘤细胞密切相关，并且在转移性肿瘤中也表现出高表达水平。波形(vimentin)蛋白通过提供粘弹性框架来保护癌细胞在迁移或挤压通过狭窄空间期间免受机械应力，并在上皮间充质转化(emt)和癌症进展期间支持细胞器(尤其是细胞核)的定位和完整性，检测vimentin mrna的表达可以更直观地反映波形蛋白的表达。因此，需要开发出同时检测两种不同的emt相关的标志物以便于更好的进行灵敏和准确的检测转移性肿瘤。本发明中，s3和s4均与s1和s2结合、s5和s6分别与s1和s2碱基互补配对形成刚性四边形结构。s6中的fam的荧光被s4中的bhq1猝灭，s5中的cy5的荧光被s3中的bhq2猝灭，因此产生低的背景信号。设计的刚性四边形生物传感器表现出有意的稳定性，且该传感平台可以对两种目标物均显示出高选择性、高灵敏度、低检测限、宽线性等优点，对于肿瘤标志物的高特异性识别具有重要的意义和实际应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种用于同时检测mirna和信使rna的刚性四边形dna生物传感器的制备方法，并将所述传感器应用于mirna-10b和vimentin mrna的高特异性同时检测。

2、本发明的目的通过如下技术方案实现。

3、一种用于同时检测mirna和信使rna的刚性四边形dna生物传感器的构建及应用，其特在于以下合成步骤：

4、s1、s2、s3、s4、s5和s6(10μl，50μm)与140μl tamg缓冲液混合均匀，在95℃退火5min，完成后迅速置于48℃水浴锅中孵育60min，自然冷却至40℃后孵育60min，自然冷却至30℃后孵育60min，自然冷却至20℃后孵育60min形成刚性四边形探针(rqp)。

5、本发明的工作原理为：

6、(1)刚性四边形生物传感器由六条dna单链组成，分别为s1、s2、s3、s4、s5和s6。

7、(2)在没有目标物的情况下，s5上5’端的cy5和s6上5’端的fam分别与s4上3’端的bhq2和s5上3’端的bhq1接近，cy5和fam的荧光被猝灭，导致较低的背景信号。

8、(3)在目标物mirna-10b存在的情况下，s5与mirna-10b结合，cy5远离bhq2，cy5的荧光信号回升；在目标物vimentin mrna存在的情况下，s6与vimentin mrna结合，fam远离bhq1，fam的荧光信号回升；两种目标物同时存在时，cy5和fam的荧光信号同时回升。

9、s1、s2、s3、s4、s5和s6的序列为：

10、s1：5’-cgcatgatcatttagaaccgaatttgtgatcctccgctat-3’；

11、s2：5’-ccagatcagacattacattcgagcaaagttcaactggtacat-3’；s3：5’-atgatcatgcgatgtaccagttg-3’；

12、s4：5’-cgcatgatcatttagaaccgaatttgtgatcctccgctat-3’；

13、s5：5’-cacaaattcggttctacagggta-3’；

14、s6：5’-ctttgctcgaatgtgcggactt-3’。

15、本发明设计得刚性四边形生物传感器可用于对mirna-10b和vimentin mrna进行高选择性同时检测。

16、荧光的检测条件设置为：激发波长：495nm和645nm，激发狭缝：5nm，发射狭缝：5nm，电压：800v。

技术特征：

1.一种用于同时检测mirna和信使rna的刚性四边形dna生物传感器的构建及应用，其特在于以下合成步骤：

2.根据权利要求1所述的一种用于同时检测mirna和信使rna的刚性四边形dna生物传感器的构建及应用，其特在于：

3.根据权利要求1所述的一种用于同时检测mirna和信使rna的刚性四边形dna生物传感器的构建及应用，其特在于s1、s2、s3、s4、s5和s6的序列：

4.根据权利要求1所述的一种用于同时检测mirna和信使rna的刚性四边形dna生物传感器的构建及应用，其特在于，该刚性四边形生物传感器可用于对mirna-10b和vimentinmrna进行高选择性同时检测。

5.根据权利要求1所述的一种用于同时检测mirna和信使rna的刚性四边形dna生物传感器的构建及应用，其特在于荧光的检测条件设置为：

技术总结
本发明提供了一种用于同时检测miRNA和信使RNA的刚性四边形DNA生物传感器的制备方法。在本发明中，六条DNA单链一锅法构建了刚性四边形生物传感器实现同时检测与癌症转移相关miRNA‑10b和vimentin mRNA。该传感器中的S5和S6分别包含了miRNA‑10b和vimentin mRNA的互补序列，S3和S4均与S1和S2结合、S5和S6分别与S1和S2碱基互补配对形成刚性四边形结构。S3的3’端修饰的猝灭团BHQ1与S6的5’端修饰的荧光团FAM靠近导致FAM的荧光猝灭；同理，S4的3’端修饰的猝灭团BHQ2与S5的5’端修饰的荧光团Cy5靠近导致Cy5的荧光猝灭。在目标物miRNA‑10b存在的情况下，miRNA‑10b将S5置换下来导致Cy5远离BHQ2，Cy5的荧光信号回升；在目标物vimentin mRNA存在的情况下，S6与vimentin mRNA结合导致FAM远离BHQ1，FAM的荧光信号回升；两种目标物同时存在时，Cy5和FAM的荧光信号同时回升，荧光信号的变化可以实现对两种目标物的定量检测，并且对两种目标物的检测均在0‑200nM呈线性关系。此发明的对miRNA‑10b和vimentin mRNA的检测具有高灵敏度，其检测限分别为2.98nM和2.23nM，这对于及时准确了解癌症的转移进展具有重要意义。

技术研发人员：蔡昌群,姚淑芬,陈峰,龚行
受保护的技术使用者：湘潭大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15