一种热敏感尿嘧啶DNA糖苷酶及其应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一种热敏感尿嘧啶dna糖苷酶及其应用。

背景技术：

1、dna扩增技术(如聚合酶链式反应(pcr)、环介导等温扩增(lamp)等)在分子诊断、微生物检测、食品检测等领域有广泛的应用。然而，在反复扩增同类样品的检测实验室环境中，往往残留相当量的前期同类扩增dna产物，很容易混入扩增反应体系中，从而成为扩增反应的模板，产生假阳性结果。这对于检测实验室是一个很大的困扰。尿嘧啶dna糖苷酶(uracil dna glycosylase，简称udg或ung)结合脱氧尿苷三磷酸(dutp)是目前最常用的解决方案。

2、udg特异性水解双链或单链dna中脱氧尿苷酸的尿嘧啶和脱氧核糖骨架之间的糖苷键，而对rna中的尿苷酸和游离的dutp无作用。dna上的尿嘧啶被水解释放后，原有位置变为无碱基位点，使得dna骨架很容易断裂降解。在解决dna扩增产物残留污染的方案中，使用dutp全部或部分替换底物脱氧核苷三磷酸(dntp)中的脱氧胸苷三磷酸(dttp)，扩增产物即含有脱氧尿苷(du)。向扩增反应体系中加入udg，在下一轮扩增之前预处理一段时间。如果反应体系中混有残留的上一轮含du dna扩增产物，udg就会将其降解；而正常模板不含du，不受udg影响。然后将udg失活，即可进行后续正常扩增。

3、使用udg处理残留dna产物污染后，必须在正常扩增反应前将其失活，否则udg也会降解正常扩增产物。目前常用的udg有两种来源，一种来源于大肠杆菌，在高温下难以完全失活，往往需要额外加入udg抑制剂，价格昂贵且操作繁琐；另一种来自大西洋鳕鱼，相对热敏感，在50℃下即可失活，在消化完残留dna产物污染后，可以直接在后续pcr反应的高温下失活，因此得到广泛应用。

4、但是，对于一步法逆转录-荧光定量pcr(rt-qpcr)而言，某些常用逆转录酶(如takara公司的primescripttmii逆转录酶和neb公司的ii逆转录酶)的最适反应温度为42℃，如果在逆转录反应前使用鳕鱼udg处理残留dna污染，则在后续逆转录反应中不能将其完全失活，其残留活性会降解一部分逆转录cdna产物，导致基因定量发生偏差。因此，需要寻找失活温度更低的热敏感udg酶。

技术实现思路

1、发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种失活温度更低的热敏感尿嘧啶dna糖苷酶(hl-udg)，可以有效解决目前常用hl-udg产品失活温度(50℃)偏高的问题，可以用于在逆转录温度低于50℃的一步法rt-qpcr反应中去除残留扩增子污染。

2、本发明还提供所述热敏感尿嘧啶dna糖苷酶的编码基因、重组载体、重组菌、重组表达纯化方法及其应用。

3、技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种热敏感尿嘧啶dna糖苷酶，所述热敏感尿嘧啶dna糖苷酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。

4、本发明编码所述热敏感尿嘧啶dna糖苷酶的基因序列，所述基因序列如seq idno.2所示。

5、其中，所述热敏感尿嘧啶dna糖苷酶由seq id no.3所示氨基酸序列为模板，以丙氨酸取代第115位的脯氨酸(l115a)，以组氨酸取代第117位的谷氨酰胺(q117h)，再将n端截去78个氨基酸。

6、本发明所述重组载体，其包括所述编码所述热敏感尿嘧啶dna糖苷酶的基因序列。

7、本发明所述一种重组菌，所述重组菌包括所述编码所述热敏感尿嘧啶dna糖苷酶的基因序列或所述重组载体。

8、本发明所述热敏感尿嘧啶dna糖苷酶重组表达纯化方法，包括如下步骤：

9、(1)将所述热敏感尿嘧啶dna糖苷酶(hl-udg)编码基因克隆到原核生物表达载体上，形成hl-udg的重组表达质粒；

10、(2)将构建成功的表达质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中发酵，然后加入诱导剂诱导hl-udg表达；

11、(3)收集重组表达的菌体，破碎离心后收集上清，进行纯化后得到hl-udg蛋白。

12、作为优选，本发明提供所述hl-udg的重组表达纯化方法：采用酶切-连接或无缝克隆等常规的分子克隆技术，将本发明所述hl-udg编码基因克隆到原核生物表达载体上，形成本发明所述hl-udg的重组表达质粒；将构建成功的表达质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中发酵一定时间，然后加入诱导剂诱导hl-udg表达；收集重组表达的菌体，破碎离心后收集上清，然后使用亲和层析、离子交换等技术进行纯化，最终获得纯度达到95％的hl-udg蛋白。

13、本发明所述热敏感尿嘧啶dna糖苷酶在一步法rt-qpcr反应中的应用。

14、本发明所述热敏感尿嘧啶dna糖苷酶在一步法rt-qpcr消除含残留du dna污染中的应用。

15、进一步地，所述应用过程为：向含du dna片段的残留扩增子污染中，加入hl-udg蛋白，孵育，加入脱氧尿苷三磷酸(dutp)，进行rt-qpcr反应即可。

16、作为优选，本发明所述hl-udg在一步法rt-qpcr反应中消除残留扩增子污染的应用：在rt-qpcr体系中加入所述hl-udg，并用dutp部分或全部替换dntps中的dttp；在rt-qpcr反应之前，25℃孵育5-10min以去除残留扩增子污染，然后按照正常程序进行rt-qpcr反应，其中逆转录温度可以降低至42℃。

17、进一步地，所述孵育温度为25-35℃，孵育时间为5-10min。

18、本发明从现有数据库筛选得到一条udg蛋白序列(seq id no.3)，但是其在40℃仍然难以完全失活，并且该全长蛋白重组表达效率低下，难以获得足够数量的蛋白，本发明对上述基因编码的氨基酸进行定点突变，以丙氨酸取代第115位的脯氨酸(l115a)，以组氨酸取代第117位的谷氨酰胺(q117h)，再将n端截去78个氨基酸获得重组酶hl-udg不仅可以高效表达，同时可以在40℃下完全热失活，不影响后续反应。

19、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

20、本发明合成的热敏感尿嘧啶dna糖苷酶(hl-udg)不仅可以高效表达，同时在40℃下不可逆热失活，可以克服目前常用热敏感udg失活温度偏高的缺陷，可以被用于聚合酶链式反应、环介导等温扩增等dna扩增过程中，去除扩增产物残留污染，尤其是逆转录反应温度在50℃以下的一步法rt-qpcr反应。

技术特征：

1.一种热敏感尿嘧啶dna糖苷酶，其特征在于，所述热敏感尿嘧啶dna糖苷酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。

2.一种编码权利要求1所述热敏感尿嘧啶dna糖苷酶的基因序列，其特征在于，所述基因序列如seq id no.2所示。

3.根据权利要求1所述热敏感尿嘧啶dna糖苷酶，其特征在于，所述热敏感尿嘧啶dna糖苷酶由seq id no.3所示氨基酸序列为模板，以丙氨酸取代第115位的脯氨酸(l115a)，以组氨酸取代第117位的谷氨酰胺(q117h)，再将n端截去78个氨基酸。

4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包括权利要求2所述的基因序列。

5.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌包括权利要求2所述的基因序列或权利要求4所述重组载体。

6.一种权利要求1所述热敏感尿嘧啶dna糖苷酶重组表达纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

7.一种权利要求1所述热敏感尿嘧啶dna糖苷酶在一步法rt-qpcr反应中消除含残留dudna污染的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用过程为：向含残留du dna扩增子污染的反应体系中，加入热敏感尿嘧啶dna糖苷酶和脱氧尿苷三磷酸(dutp)，低温孵育后，正常进行rt-qpcr反应即可。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述孵育温度为25-35℃。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述孵育时间为5-10min。

技术总结
本发明公开了一种热敏感尿嘧啶DNA糖苷酶及其应用，所述热敏感尿嘧啶DNA糖苷酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述热敏感尿嘧啶DNA糖苷酶的基因序列如SEQ ID NO.2所示。本发明所述的热敏感尿嘧啶DNA糖苷酶在40℃下不可逆热失活，可以克服此前常用热敏感UDG失活温度偏高的缺陷，可用于逆转录反应温度在50℃以下的一步法RT‑qPCR反应。

技术研发人员：卢辰,罗志丹,许恒皓,张雅琪,任宏杰,黄庆媛,陈科奇,徐喆
受保护的技术使用者：江苏省海洋资源开发研究院（连云港）
技术研发日：
技术公布日：2024/1/25