一种数字PCR检测KPC耐药基因的方法及试剂盒

本发明涉及一种利用数字pcr技术定量检测kpc耐药基因的试剂盒及检测方法，属于生物。

背景技术：

1、碳青霉烯是有着广谱抗菌活性的一类β-内酰胺类抗生素，常作为治疗高产ampc和超广谱的β-内酰胺酶的革兰阴性杆菌引起的感染的最有效的药物。但随着碳青霉烯类抗生素的广泛使用，细菌也逐渐获得对此类药物的耐药性。近年来，耐碳青霉烯的非发酵菌已成为医院感染的严重问题，而且耐碳青霉烯的肠杆菌细菌的报道也越来越多，这种耐碳青霉烯的革兰阴性杆菌的快速传播和流行正日益成为令人担忧的全球性问题。

2、细菌对碳青霉烯类抗生素耐药主要原因是产生碳青霉烯酶，其包括ambler分子分类的a、b、d三类酶。其中a类中的新增成员kpc(klebsiella pneumoniae carbapenemase)，因其能够水解除头霉素类以外几乎所有的β-内酰胺类抗菌药物而引起了世界各国抗感染专家和临床微生物工作者的极大关注。携带有kpc基因的细菌也被称为“超级细菌”。由kpc型的“超级细菌’感染造成的暴发流行，往往使治疗陷入无药可用的境地，给临床抗感染治疗带来极大挑战。因此及时检测kpc基因，对细菌耐药表型进行监测，控制和杜绝超级细菌的爆发流行显得至关重要。

3、目前主要利用分子生物学技术检测携带kpc基因的超级细菌，pcr的方法更是被誉为检测的“金标准”。但普通pcr容易产生非特异性扩增，甚至会因为操作的原因出现假阳性或假阴性，而且普通pcr的结果判断需要对产物进行凝胶电泳分析，操作不够简化。目前尚缺乏一种灵敏度高、特异性好、操作简便的方法。

4、数字pcr(digital pcr，dpcr)，即通过将一个样本分成大量等份，然后分配到不同的独立反应，每个独立反应单元至少包含一个拷贝的目标分子(核酸模板)，在每个独立反应的中分别对目的模板分子进行pcr扩增，然后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。目前数字pcr主要在癌症标志物稀有突变检测、致病微生物检测、基因表达分析以及拷贝数变异分析等科研领域有较广泛的应用，同时也可以与高通量测序无缝对接，验证测序结果。

5、因此，本领域亟需一种利用数字pcr技术定量检测kpc耐药基因的试剂盒及检测方法。

技术实现思路

1、本发明的所要解决的问题是：现有技术中缺少利用数字pcr技术定量检测kpc耐药基因的试剂盒及检测方法。

2、为达到解决上述问题的目的，本发明所采取的技术方案是提供一种利用数字pcr技术定量检测kpc耐药基因的试剂盒及检测方法。

3、本发明的第一方面，提供了一种利用数字pcr技术定量检测kpc耐药基因的检测方法，包括以下步骤：

4、步骤1：先将pcr buffer(含rox)、引物对、探针和dna模板充分融化，充分混匀，然后使用离心机离心至管底，放在冰上备用；

5、步骤2：反应体系配置，其中，10×浓度的pcr buffer 2ul，正向引物(f，10um)1ul，反向引物(r，10um)1ul，探针(p，5um)1ul，h20 13ul，dna模板2ul，混合均匀；

6、步骤3：微滴制备，使用pcr系统中的全自动上样仪将20ul pcr反应液均匀分散至芯片中；

7、步骤4：扩增，将芯片放置于扩增仪中，按该程序进行扩增，先在95℃温度下预变性5min；然后进行45个循环，其中每个循环依次进行95℃，30s和56℃，45s；

8、步骤5：芯片阅读，将扩增后的芯片放置于芯片阅读仪中，进行芯片阅读分析；

9、其中，dna模板的序列如seq id no 1所示；

10、引物对的序列如seq id no 2、seq id no 3所示，包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于测试序列的第304-323位；其中的反向引物结合于测试序列的第420-439位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为136bp；

11、探针的序列如seq id no 4所示；

12、seq id no 1为：

13、acagtgataacgccgccgccaatttgttgctgaaggagttgggcggcccggccgggctgacggccttcatgcgctctatcggcgataccacgttccgtctggaccgctgggagctggagctgaactccgccatcccaggcgatgcgcgcgatacctcatcgccgcgcgccgtgacggaaagcttacaaaaactgacactgggctctgcactggctgcgccgcagcggcagcagtttgttgattggctaaagggaaacacgaccggcaaccaccgcatccgcgcggcggtgccggcagactgggcagtcggagacaaaaccggaacctgcggagtgtatggcacggcaaatgactatgccgtcgtctggcccactgggcgcgcacctattgtgttggccgtctacacccgggcgcctaacaaggatgacaagcacagcgaggccgtcatcgccgctgcggctagactcgcgctcgagggattgggcgtcaacgggcagtaa

14、seq id no 2为：cagtcggagacaaaaccgga

15、seq id no 3为：tcgctgtgcttgtcatcctt

16、seq id no 4为：tatggcacggcaaatgacta。

17、本发明的第二方面，提供了一种利用数字pcr技术定量检测kpc耐药基因的试剂盒，包括核苷酸序列如seq id no 1至seq id no 4所示的引物、dna模板和探针。

18、相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

19、数字pcr系统可将pcr反应体系均匀分割成数万个反应微滴，每个微滴平行、独立完成pcr扩增，通过判定每个微滴扩增完成后荧光信号的有无进行统计，根据泊松分布公式计算得到原体系中靶标基因的初始浓度或拷贝数，实现对待测靶标的绝对定量。由于整个实验过程都是在完全封闭的系统中运行，避免了交叉污染，使得结果更加客观真实，同时在扩增时结合了特异探针的杂交，进一步提高了实验的敏感性和特异性。

技术特征：

1.一种利用数字pcr技术定量检测kpc耐药基因的检测方法，包括以下步骤：

2.一种利用数字pcr技术定量检测kpc耐药基因的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括核苷酸序列如seq id no 1至seq id no 4所示的引物、dna模板和探针。

技术总结
本发明涉及一种利用数字PCR技术定量检测KPC耐药基因的检测方法及试剂盒，包括备用、反应体系配置、微滴制备、扩增、芯片阅读，其中DNA模板的序列、引物对的序列、探针的序列如SEQ ID NO 1～SEQ ID NO 4所示。属于生物技术领域。数字PCR系统可将PCR反应体系均匀分割成数万个反应微滴，每个微滴平行、独立完成PCR扩增，进一步提高了实验的敏感性和特异性。

技术研发人员：王一雪,张彩艳,陆国平,陈伟明,闫钢风,刘静
受保护的技术使用者：复旦大学附属儿科医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15