一种细胞蛋白提取液、其制备方法及用途与流程

本发明涉及肿瘤治疗，尤其涉及一种细胞蛋白提取液、其制备方法及用途。

背景技术：

1、源自人体自己的细胞、蛋白是可以应用于人体的，比如人红细胞、白蛋白、球蛋白等，这些应用都是以药品管理的方式或方案进行推进。自体肿瘤治疗疫苗是近年发展起来的一类新型肿瘤治疗技术，并已广泛应用于临床肿瘤治疗研究。这类治疗中往往需要患者自体的肿瘤抗原组（蛋白），解决这一需求往往是在临床医院，由医生兼职完成，传统科研实验室常用的蛋白提取方案不适合临床应用（部分制剂可能回输人体），这就需要为临床提供一种适应的方案，快速安全的获得细胞的蛋白组份，并在适合的情况下应用于临床。

2、真核细胞蛋白提取有着成熟的方案，如ripa法、液氮反复冻融法、液氮研磨法、超声破碎、或热裂解法等。但这些方案无疑都存在着不适合临床应用的成分：如ripa法会引入sds等离子型去污剂、液氮冻融和研磨法需要液氮，操作时间长，超声、热裂解对细胞和蛋白的影响较大，出现非预期蛋白、蛋白变性后复性率低等等。具体表现为：（1）细胞裂解过程中引入过多去污剂、还原剂等对人体有害的试剂：依据裂解程度的不同，ripa法会引入较高浓度的去污剂，尤其是sds等离子型去污剂的引入，造成制剂不能应用于人体或制备物不能应用于人体方面；（2）不符合人体细胞被破坏的生理情况：正常的人体破坏，更多的是以凋亡的形式发生，而非利用加热、超声等直接破坏细胞；（3）需要使用蛋白酶抑制剂等试剂：这类物品会阻抑生命的生理活动，从而影响诸多代谢环节，这一类物质是不能应用于人体的；（4）蛋白提取时间较长，如反复冻融的方案，通常3次冻融需要超过数小时，不利于临床快速处理；（5）非预期的变化引入：如热裂解会产品hsp、同时热变性后的蛋白有很多不可逆，从而损失较多蛋白；（6）特定条件的要求：如需要液氮罐、-80°冰箱等非临床应用条件；（7）主要应用于基础研究，不适合人体临床：科研后续研究如sds-page、malditof、氨基酸测序、蛋白结晶等，与临床应用的提取差异较大。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的不足，提供一种细胞蛋白提取液、其制备方法及用途。

2、本发明是通过以下技术方案予以实现：

3、一种细胞蛋白提取液，包括组分a和组分b，所述组分a包括体积分数为1%的tween20以及体积分数为6%的双氧水或蒸馏水，所述组分b包括0.2mol/l 二硫苏糖醇（dtt）、0.01mol/l、ph6.0 磷酸缓冲液（pb）以及300mmol/l nacl溶液。

4、根据上述技术方案，优选地，还包括乙醇溶液，乙醇溶液为无水乙醇，所述乙醇溶液的体积为组分a或组分b的体积的6倍以上，所述乙醇溶液的浓度不低于75%。

5、本专利还公开了一种细胞蛋白提取液制备方法，用于制备上述一种细胞蛋白提取液，包括如下步骤：

6、s1.收集癌细胞，以2%（细胞重量/g：组分a溶液/ml）的比例加入所述组分a，混合静置；

7、s2.加入与组分a等量体积的所述组分b，混合静置；

8、s3.加入6倍以上组分a或组分b的体积的所述乙醇溶液，离心后收集沉淀，沉淀用培养基混匀悬浮，获得蛋白提取物溶液。

9、根据上述技术方案，优选地，步骤s1、s2中，所述混合静置包括：涡旋20s或手动震荡30s，静置2分钟。

10、根据上述技术方案，优选地，步骤s3包括：加入6倍以上组分a或组分b的体积的所述乙醇溶液，涡旋20s或手动震荡30s；离心12000rpm、2min后收集沉淀，沉淀用培养基混匀悬浮，获得蛋白提取物溶液。

11、本专利同时公开了一种细胞蛋白提取液的用途，基于上述一种细胞蛋白提取液制备方法，用于dc细胞的肿瘤抗原负载，具体包括以下步骤：

12、s41.采集人外周抗凝血并稀释；

13、s42.将稀释后的抗凝血加在淋巴细胞分离液上部，离心并取白膜层；

14、s43.采用无菌pbs缓冲液洗涤，离心收集细胞沉淀，沉淀用1640培养基制备悬浮细胞液，过夜培养12h以上；

15、s44.次日缓慢吸出培养液及未贴壁细胞，加入等量新的1640培养基，继续培养48h；

16、s45.采用培养基半量换液，加入所述蛋白提取物溶液，并控制蛋白浓度，使蛋白浓度达3ug蛋白提取物/ml培养基，培养48h。

17、根据上述技术方案，优选地，在步骤s41中，采集人外周抗凝血10ml，用无菌pbs缓冲液按照体积比1:1稀释。

18、根据上述技术方案，优选地，在步骤s42中，在离心管中加入5ml淋巴细胞分离液，将稀释后的抗凝血加在其上部，离心1500rpm、20min，取白膜层。

19、本发明的有益效果是：

20、本发明采用组分a、组分b相互配合，快速充分破解细胞，组分b中含有还原剂及高浓度盐溶液，与组分a等比混合后，既中和了组分a中的过氧化物，并纠正了低渗对蛋白的损伤，同时将ph调整至蛋白易于沉淀出来，提取过程对操作人要求极低，操作人容易掌握，能够快速安全的获得细胞的蛋白组份，可用于癌症的临床治疗。

技术特征：

1.一种细胞蛋白提取液，其特征在于，包括组分a和组分b，所述组分a包括体积分数为1%的tween20以及体积分数为6%的双氧水或蒸馏水，所述组分b包括0.2mol/l 二硫苏糖醇、0.01mol/l 磷酸缓冲液以及300mmol/l nacl溶液。

2.根据权利要求1所述一种细胞蛋白提取液，其特征在于，还包括乙醇溶液，所述乙醇溶液的体积为组分a或组分b的体积的6倍以上。

3.根据权利要求2所述一种细胞蛋白提取液，其特征在于，所述乙醇溶液为无水乙醇。

4.一种细胞蛋白提取液制备方法，用于制备权利要求2或3中所述一种细胞蛋白提取液，其特征在于，包括如下步骤：

5.根据权利要求4所述一种细胞蛋白提取液制备方法，其特征在于，步骤s1、s2中，所述混合静置包括：涡旋20s或手动震荡30s，静置2分钟。

6.根据权利要求4所述一种细胞蛋白提取液制备方法，其特征在于，步骤s3包括：加入6倍以上组分a或组分b的体积的所述乙醇溶液，涡旋20s或手动震荡30s；离心12000rpm、2min后收集沉淀，沉淀用培养基混匀悬浮，获得蛋白提取物溶液。

7.一种细胞蛋白提取液的用途，基于权利要求4所述一种细胞蛋白提取液制备方法，其特征在于，用于dc细胞的肿瘤抗原负载。

8.根据权利要求7所述一种细胞蛋白提取液的用途，其特征在于，包括如下步骤：

9.根据权利要求8所述一种细胞蛋白提取液的用途，其特征在于，在步骤s41中，采集人外周抗凝血10ml，用无菌pbs缓冲液按照体积比1:1稀释。

10.根据权利要求9所述一种细胞蛋白提取液的用途，其特征在于，在步骤s42中，在离心管中加入5ml淋巴细胞分离液，将稀释后的抗凝血加在其上部，离心1500rpm、20min，取白膜层。

技术总结
本发明涉及一种细胞蛋白提取液、其制备方法及用途，包括组分a和组分b，组分a包括tween20以及双氧水或蒸馏水，组分b包括二硫苏糖醇、磷酸缓冲液以及NaCl溶液；其制备方法为：收集癌细胞，以2%的比例加入组分a混合静置；加入与组分a等量体积的组分b混合静置；加入乙醇溶液，离心后收集沉淀，沉淀用培养基混匀悬浮，获得蛋白提取物溶液。本发明采用组分a、组分b相互配合，快速充分破解细胞，组分b中含有还原剂及高浓度盐溶液，与组分a等比混合后，既中和了组分a中的过氧化物，并纠正了低渗对蛋白的损伤，提取过程对操作人要求极低，能够快速安全的获得细胞的蛋白组份，可用于癌症的临床治疗。

技术研发人员：邓为民,徐世文,于建春,李阳,郁春艳,许潭
受保护的技术使用者：天津纽赛生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16