海洋生物被膜细菌的富集培养及其基因组的获取方法

本发明属于海洋微生物检测，具体涉及海洋生物被膜细菌的富集培养及其基因组的获取方法。

背景技术：

1、目前的细菌培养方法通常适用于具有特定代谢能力的细菌，如氨氧化菌、解磷菌等，覆盖面较窄，通用性较差，无法实现广谱地培养复杂群落中的多种细菌。产生该技术问题的原因主要有以下三方面：1）富集培养基碳源单一，如仅用葡萄糖作为碳源，无法表征环境中复杂多样的碳源种类；2）未添加或仅添加单一的微量元素，不利于对微量元素需求较高的细菌培养；3）除培养基的营养物质因素，未考虑培养条件因素，如ph值波动对微生物生长产生的影响。

2、此外，目前的细菌培养方法未有设计相对应的富集后获取其基因组信息的方法，获取基因组信息不完整。原因如下：一方面，目前的细菌培养方法是建立在三代dna测序普及应用之前，直接通过二代dna测序，由于其读长较短无法获得较长的重叠群，从而无法获得完整度高、污染度低的高质量基因组（mags）；另一方面是由于生物信息学技术的限制，现有技术建立时缺乏实现二代dna序列和三代dna序列的混合组装的软件。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供了海洋生物被膜细菌的富集培养及其基因组的获取方法，可高效培养得到结构复杂且稳定的微生物群落，并获得该群落的高质量细菌基因组。

2、本发明通过以下技术方案实现：

3、本发明所述的海洋生物被膜细菌的富集培养方法，包括以下步骤：

4、（1）采样：采集海洋生物被膜样品。

5、优选的，海洋生物被膜样品优选来自浸没在海水中的岩石表面，人类活动影响较低的海洋区域。

6、（2）样品处理：将采集的样品通过离心去上清液，得到菌体沉淀，将菌体沉淀洗涤后重悬于无菌海水中，再通过过滤得到生物被膜细菌细胞，静置保存。

7、优选的，离心转速为5000-6000rpm，时间为5-6min；

8、对菌体沉淀进行洗涤的目的是去除碳源营养，洗涤液为pbs；

9、无菌海水是将人工海盐溶于超纯水中灭菌后制得，人工海盐添加量为30g/l；

10、过滤采用3μm纤维素酯膜过滤器，可过滤真菌、藻类和其他颗粒；

11、静置保存温度为2-8℃，时间为14-18h，目的为消耗剩余的碳源营养。

12、（3）配制培养基：培养基包括碳源物质和非碳源物质，非碳源物质的种类和添加量见表1，碳源物质的种类为表2中物质的任意一种，添加量为1g/l，分别制备得到表2中69种碳源物质相对应的69种培养基。

13、优选的，所述培养基的ph为6.5-7.5；

14、所述培养基还包括hepes，添加量为1mol/l，用于稳定微生物群落生长过程中的ph。

15、表1 所述培养基中非碳源物质

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17、表2 所述培养基中碳源物质

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19、（4）富集培养：将步骤（2）得到的生物被膜细菌细胞分别接种到步骤（3）制备的培养基中，每种培养基均设有氧培养和无氧培养两种培养条件，黑暗条件下静置培养至生物被膜形成，收集生物被膜菌体并用液氮冷冻，储存用于后续dna提取。

20、优选的，培养温度为25-26℃，培养时间20-30天，收集生物被膜菌体时的细菌密度od600为0.8-1.2，菌体保存温度≤-80℃；

21、有氧培养的气体环境为80%的氮气和20%的氧气，无氧培养的气体环境为氮气；

22、氮气为高纯度氮气，纯度为99.999%。

23、本发明所述的海洋生物被膜细菌基因组的获取方法，通过宏基因组测序和宏基因组分箱技术实现，具体包括以下步骤：

24、s1、将收集的生物被膜菌体通过illumina测序技术进行测序，共138个样品，每个分别获取20g的数据量，并对测序数据通过分箱软件maxbin（v2.2.6）获得mags；

25、s2、将步骤s1获得的完整度大于80%、污染度大于5%的mags用metabat（v0.32.5）进行分箱；

26、s3、将步骤s2获得的完整度大于80%、污染度大于5%的mags用concoct（v1.1.0）进一步分箱；

27、s4、将表2中醇、氨基酸、有机酸、糖四类碳源培养的生物被膜菌体分别混合为4个样本进行nanopore测序，将通过测序获得的长读长序列和步骤s1、s2、s3分箱获得的完整度大于80%、污染度小于5%的mags进行重组装，即可获得完整度大于90%、污染度小于5%的高质量非冗余mags。

28、步骤s4中所述重组装具体包括以下步骤：

29、s41、将原始mag构建为索引，使用bowtie2将illumina序列映射到原始mag索引，并使用samtools（v1.11）提取匹配的序列；

30、s42、针对原始mag对nanopore数据进行blastn搜索，并且保留具有99%以上同一性的匹配序列；

31、s43、在单基因组模式中，使用软件spades（v3.12.0）对给定mag匹配上的illumina和nanopore序列交叉组装。

32、所述高质量非冗余mags的平均核苷酸相似度（ani，average nucleotideidentity）低于99%。

33、基因组质量均通过软件checkm（v1.1.2）检测。

34、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

35、1、本发明所述培养基配方包含了多种在海洋水体中丰富存在的溶解有机碳和多种维生素成分，同时使用了ph缓冲液。经过测试100多种碳源的培养能力，以最终可获得的生物量作为指标，最终得到了69种碳源作为唯一碳源对生物被膜群落进行富集培养。根据其化学性质，这些碳源可分为四类：醇类、氨基酸、有机酸和糖类，这些碳源的使用实现了不同碳源下的宏基因组中的细菌基因组高效分流。本发明中使用了多种维生素成分，而其他培养基成分，如氮源，成分简单，可排除其它不必要的成分影响。此外，本发明培养基中加入hepes缓冲液，该缓冲体系对稳定富集培养过程中ph的波动具有较好的效果。

36、2、本发明中每一种碳源的培养基都对应设有有氧和无氧两种培养条件，每种氧气条件下培养得到的微生物群落都独立进行二代宏基因组学测序，该方法获取的文件对于后续的二维宏基因组分箱十分有利。此外，同种类型碳源培养基富集培养的微生物群落样品合并后进行了三代dna测序，获得长读长序列，二代和三代数据的混合拼装对于分箱过程中显著提高了基因组的完整度。

技术特征：

1.一种海洋生物被膜细菌的富集培养方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的海洋生物被膜细菌的富集培养方法，其特征在于：步骤（2）中，过滤采用3μm纤维素酯膜过滤器。

3.根据权利要求1所述的海洋生物被膜细菌的富集培养方法，其特征在于：步骤（2）中，静置保存温度为2-8℃，时间为14-18h。

4.根据权利要求1所述的海洋生物被膜细菌的富集培养方法，其特征在于：步骤（3）中，所述培养基的ph为6.5-7.5。

5.根据权利要求1所述的海洋生物被膜细菌的富集培养方法，其特征在于：步骤（3）中，所述培养基还包括hepes，添加量为1mol/l。

6.根据权利要求1所述的海洋生物被膜细菌的富集培养方法，其特征在于：步骤（4）中，培养温度为25-26℃，培养时间20-30天。

7.根据权利要求1所述的海洋生物被膜细菌的富集培养方法，其特征在于：步骤（4）中，收集生物被膜菌体时的细菌密度od600为0.8-1.2。

8.一种权利要求1-7任一项所述的富集培养方法获得的海洋生物被膜细菌的基因组获取方法，其特征在于：包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的海洋生物被膜细菌的基因组获取方法，其特征在于：步骤s4中所述重组装具体包括以下步骤：

技术总结
本发明属于海洋微生物检测技术领域，具体涉及海洋生物被膜细菌的富集培养及其基因组的获取方法。本发明建立了新的用于海洋微生物富集培养的培养基配方，包括非碳源成分和选择的69种有效碳源，并设计了培养条件和宏基因组测序方案，从而成功地在实验室培养海洋生物被膜菌群或获得高完整度的535个细菌基因组。通过本发明方法可以高效培养得到来自多个门的结构复杂且稳定的微生物群落，以及在该群落中丰度较高的细菌基因组，为下游进一步开发微生物资源以及改进培养方法提供了基础和导向。

技术研发人员：张伟鹏,崔涵,丁维,范燊
受保护的技术使用者：中国海洋大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16