一种卷曲乳杆菌及其应用的制作方法

本发明属于微生物，具体涉及一种卷曲乳杆菌及其应用。

背景技术：

1、女性阴道被一系列不同的微生物定植，这些微生物组成了阴道微生物区系。健康女性阴道优势菌主要以乳杆菌属为主，这些乳杆菌通过不同作用机制有效拮抗致病菌。结合当前研究和乳杆菌在其他疾病缓解方面的作用机制研究，其在阴道中发挥的可能机制主要包括:(1)乳杆菌产生有效抗菌物质,如有机酸、过氧化氢(h2o2)、短链脂肪酸、细菌素等抗菌物质抑制致病菌的生长。(2)乳杆菌竞争黏附作用，乳杆菌通过与致病菌竞争上皮细胞的黏附位点，形成空间位阻，阻止致病菌的黏附和定植。(3)乳杆菌对阴道黏膜屏障的保护作用，阴道的上表皮覆盖着宫颈阴道黏液层。黏液层是与阴道微生物首先接触的部位，也是构成阴道屏障的重要组成之一。宫颈阴道粘液屏障的特性与黏附于其上的阴道微生物有关。(4)乳杆菌的免疫调节作用，乳杆菌可通过参与宿主局部免疫应答，调节由阴道炎相关致病菌引起的免疫反应。(5)乳杆菌对阴道菌群的调节作用，但是目前使用现有的菌种制得的抑菌剂其抑菌效果均比较差，生长活力差，现有的菌种在制备成抑菌产品后，无法实现长效抑菌，更无法有效治疗宫颈糜烂、阴道炎、白带异常等阴道疾病，而且为了强化其抑菌效果，还在抑菌片中加入大量的化学药品，这些化学抑菌剂虽然具备杀菌效果，但是同时会破坏阴道中健康的菌群环境，造成阴道疾病的反复感染，因此，现有技术需要进一步的改进。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一株生长活力好，产酸能力强，抑菌效果好的抑菌性卷曲乳杆菌及应用。

2、一种卷曲乳杆菌，所述卷曲乳杆菌已于2023年6月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.27662，分类命名为lactobacillus crispatus bhc04。

3、进一步的，所述的卷曲乳杆菌的16s rdna全序列如seq id no:1所示。

4、一种上述的卷曲乳杆菌分离纯化的方法，由以下步骤制备而成：(1)用无菌棉签从阴道下部的侧壁1/3处取得阴道分泌物，放入带有生理盐水的无菌试管中，于3-5℃下保存，得富集液；

5、(2)取步骤(1)中的富集液0.5-1ml，使用生理盐水稀释至10-2-10-4梯度后，再稀释后的富集液于mrs琼脂培养基平板上涂布，并在35-38℃的厌氧环境下倒置培养48h-60h，再挑取单个特征菌，该特征菌的直径在0.3-1.0mm之间，菌落圆形，中部隆起、光滑湿润、呈乳白色边缘整齐，白色，表面湿润光滑，在35-38℃下厌氧培养48h-60h，反复划线至同一平板中的菌落颜色、大小、形状均一致，然后将菌落移接至含有mrs液体培养基的厌氧管中培养22-25h，得分离纯化后的卷曲乳杆菌。

6、进一步的，所述的步骤(1)中阴道分泌物与生理盐水的质量体积比为1-3g∶2-4ml，该生理盐水的质量浓度为8-9g/l。

7、进一步的，所述的步骤(2)中使用生理盐水稀释过的富集液与mrs琼脂培养基的体积比为：80-100μl：20-30ml；所述的步骤(2)中卷曲乳杆菌的菌落与mrs液体培养基的质量体积比为1-2g：100-200ml。

8、进一步的，所述的mrs液体培养基培养，由以下重量份数原料组成，酵母膏3-7份，蛋白胨8-12份，牛肉膏8-12份，乙酸钠3-7份，葡萄糖18-22份，柠檬酸二铵2-3份，k2hpo4·3h2o 2.68-3.15份，mnso4·h2o 0.05-0.08份，mgso40.048-0.052份，l-半胱氨酸盐酸盐0.3-0.7份；所述的mrs琼脂培养基，由以下重量份数原料组成，酵母膏3-7份，蛋白胨8-12份，牛肉膏8-12份，乙酸钠3-7份，葡萄糖18-22份，柠檬酸二铵2-3份，k2hpo4·3h2o 2.68-3.15份，mnso4·h2o 0.05-0.08份，mgso40.048-0.052份，l-半胱氨酸盐酸盐0.3-0.7份，琼脂粉13-17份。

9、一种含上述卷曲乳杆菌的阴道抑菌片，由以下重量分数的原料组成：卷曲乳杆菌粉0.3-0.7份，嗜酸乳杆菌粉0.2-0.5份、木糖醇60-90份、麦芽糊精2-5份、抗结剂0.2-0.5份。

10、进一步的，所述的卷曲乳杆菌粉为冻干粉，卷曲乳杆菌粉中活菌含量大于1.0×109cfu/g；所述的卷曲乳杆菌粉和嗜酸乳杆菌粉为冻干粉，嗜酸乳杆菌粉活菌含量大于1.0×108cfu/g。

11、进一步的，所述的抗结剂为二氧化硅粉末或者硬脂酸镁。

12、一种使用上述卷曲乳杆菌的阴道抑菌片制备方法，由以下步骤组成：将卷曲乳杆菌和嗜酸乳杆菌制备成冻干粉并混合均匀，在30-34℃下放置30-35min后与麦芽糊精按照“等量递加法”混匀，继而加入称重好的木糖醇、抗结剂混合均匀后，进入压片机压制成片，即得成品。

13、本发明的卷曲乳杆菌具有较强的生长能力和产酸能力，并且本发明的卷曲乳杆菌发酵上清液对金黄葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌均具有较强的抑制能力本发明制得阴道抑菌片可以有效治疗宫颈糜烂、念珠性阴道炎、白带异常等疾病，无复发。

技术特征：

1.一种卷曲乳杆菌，其特征在于，所述卷曲乳杆菌已于2023年6月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.27662，分类命名为lactobacillus crispatus bhc04。

2.根据权利要求1所述的卷曲乳杆菌，其特征在于，所述的卷曲乳杆菌的16s rdna全序列如seq id no:1所示。

3.一种权利要求1-2所述的卷曲乳杆菌分离纯化的方法，其特征在于，由以下步骤制备而成：

4.根据权利要求3所述的卷曲乳杆菌的分离纯化的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中阴道分泌物与生理盐水的质量体积比为1-3g∶2-4ml，该生理盐水的质量浓度为8-9g/l。

5.根据权利要求3所述的分离纯化的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中使用生理盐水稀释过的富集液与mrs琼脂培养基的体积比为：80-100μl：20-30ml；所述的步骤(2)中卷曲乳杆菌的菌落与mrs液体培养基的质量体积比为1-2g：100-200ml。

6.根据权利要求3所述的分离纯化的方法，其特征在于，所述的mrs液体培养基培养，由以下重量份数原料组成，酵母膏3-7份，蛋白胨8-12份，牛肉膏8-12份，乙酸钠3-7份，葡萄糖18-22份，柠檬酸二铵2-3份，k2hpo4·3h2o 2.68-3.15份，mnso4·h2o 0.05-0.08份，mgso40.048-0.052份，l-半胱氨酸盐酸盐0.3-0.7份；所述的mrs琼脂培养基，由以下重量份数原料组成，酵母膏3-7份，蛋白胨8-12份，牛肉膏8-12份，乙酸钠3-7份，葡萄糖18-22份，柠檬酸二铵2-3份，k2hpo4·3h2o 2.68-3.15份，mnso4·h2o 0.05-0.08份，mgso40.048-0.052份，l-半胱氨酸盐酸盐0.3-0.7份，琼脂粉13-17份。

7.一种含权利要求5中卷曲乳杆菌的阴道抑菌片，其特征在于，由以下重量分数的原料组成：卷曲乳杆菌粉0.3-0.7份，嗜酸乳杆菌粉0.2-0.5份、木糖醇60-90份、麦芽糊精2-5份、抗结剂0.2-0.5份。

8.根据权利要求5中卷曲乳杆菌的阴道抑菌片，其特征在于，所述的卷曲乳杆菌粉为冻干粉，卷曲乳杆菌粉中活菌含量大于1.0×109cfu/g；所述的卷曲乳杆菌粉和嗜酸乳杆菌粉为冻干粉，嗜酸乳杆菌粉活菌含量大于1.0×108cfu/g。

9.根据权利要求5中卷曲乳杆菌的阴道抑菌片，其特征在于，所述的抗结剂为二氧化硅粉末或者硬脂酸镁。

10.一种使用权利要求9所述的卷曲乳杆菌的阴道抑菌片制备方法，其特征在于，由以下步骤组成：将卷曲乳杆菌和嗜酸乳杆菌制备成冻干粉并混合均匀，在30-34℃下放置30-35min后与麦芽糊精按照“等量递加法”混匀，继而加入称重好的木糖醇、抗结剂混合均匀后，进入压片机压制成片，即得成品。

技术总结
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种卷曲乳杆菌及其应用。所述卷曲乳杆菌已于2023年6月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.27662，分类命名为Lactobacillus crispatus BHC04。本发明的卷曲乳杆菌具有较强的生长能力和产酸能力。

技术研发人员：孟珺,丁长河,郑冬鸽,杜涵,董盼盼,辛向鸽,杜灵广
受保护的技术使用者：郑州金百合生物工程有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/21