一种检测9种致病细菌的引物探针组和微流控芯片

本发明属于生物检测，具体涉及一种检测9种致病细菌的引物探针组和微流控芯片。

背景技术：

1、传统的生物威胁病原检测方法包括：细菌培养、生化分析、细胞和动物实验等，这些方法不仅所需设备数量和种类多、体积庞大，而且操作过程繁琐、检测周期长，无法满足现场快速检测的要求。基于扩增的核酸检测方法，可以实现多种细菌、病毒或真菌等的并行、快速、高灵敏度和高特异性检测，是生物威胁病原检测的一种理想方法。但是，常规的核酸检测技术，一方面自动化程度低，例如需要手动利用试剂盒进行核酸提取等，极大增加了操作者遭受生物战剂危害的风险，容易造成人员伤亡；另一方面，核酸提取、扩增和检测分离等操作，容易导致样品污染、出现假阳性等问题，无法满足生物威胁病原现场一体化快速检测的迫切要求。

2、20世纪90年代发展起来的微流控技术，具有样品和试剂消耗量极少、灵敏度高、检测速度快、通量高、微型化、集成化和便携化等优点。因此，近年来研究者提出利用微流控技术，将核酸提取、扩增和检测全部集成在封闭的微流控芯片中，既可以有效降低检测人员遭受生物危害的风险，又可以避免出现污染和假阳性等问题，但是目前并没有针对炭疽芽孢杆菌、土拉弗朗西斯菌、霍乱弧菌、鼻疽伯克霍尔德菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、鹦鹉热衣原体和q热立克次体的微流控芯片。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种检测9种致病细菌的引物探针组和微流控芯片，灵敏度高，特异性好。

2、本发明提供了一种检测9种致病细菌的引物探针组，包括针对炭疽芽孢杆菌(bacillus anthracis)、土拉弗朗西斯菌(francisella tularensis)、霍乱弧菌(vibriocholerae)、鼻疽伯克霍尔德菌(burkholderia mallei)、类鼻疽伯克霍尔德菌(burkholderiapseudomallei)、鼠疫耶尔森菌(yersiniapestis)、布鲁菌(brucella)、鹦鹉热衣原体(chlamydiapsittaci)和q热立克次体(coxiella burnetii)的保守序列依次设计的引物探针组。

3、优选的，所述q热立克次体、鹦鹉热衣原体、鼠疫耶尔森菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、布鲁菌、炭疽芽孢杆菌、鼻疽伯克霍尔德菌、土拉弗朗西斯菌和霍乱弧菌的保守序列的核苷酸序列依次如seq id no.28～seq id no.36所示。

4、优选的，针对所述q热立克次体设计的引物探针组的核苷酸序列如seq idno.1～seq id no.3所示；

5、针对所述鹦鹉热衣原体设计的引物探针组的核苷酸序列如seq id no.4～seq idno.6所示；

6、针对所述鼠疫耶尔森菌设计的引物探针组的核苷酸序列如seq id no.7～seq idno.9所示；

7、针对所述类鼻疽伯克霍尔德菌设计的引物探针组的核苷酸序列如seq id no.10～seq id no.12所示；

8、针对所述布鲁菌设计的引物探针组的核苷酸序列如seq id no.13～seq idno.15所示；

9、针对所述炭疽芽孢杆菌设计的引物探针组的核苷酸序列如seq id no.16～seqid no.18所示；

10、针对所述鼻疽伯克霍尔德菌设计的引物探针组的核苷酸序列如seq id no.19～seq id no.21所示；

11、针对所述土拉弗朗西斯菌设计的引物探针组的核苷酸序列如seq id no.22～seqid no.24所示；

12、针对所述霍乱弧菌设计的引物探针组的核苷酸序列如seq id no.25～seq idno.27所示。

13、优选的，在每条探针的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。

14、本发明还提供了上述引物探针组在制备检测9种致病细菌的工具中的应用。

15、优选的，所述工具包括微流控芯片。

16、本发明还提供了一种同时检测9种致病细菌的微流控芯片，所述微流控芯片包括上述引物探针组。

17、优选的，所述引物探针组固化在微流控芯片中。

18、优选的，当利用所述微流控芯片进行所述9种致病细菌的检测时，ct值大于40认定为阴性，ct值为40时需重新检测，0＜ct值＜40时认定为阳性。

19、优选的，每一种致病细菌的引物探针组的固化，包括以下步骤：将上游引物、下游引物和探针共同溶解到无菌水中，得引物探针液；将溶解后的琼脂糖加入所述引物探针液中，混合均匀，得混合液；利用所述混合液点样反应孔，冻干后进行芯片封装。

20、有益效果：本发明提供了一种检测9种致病细菌的引物探针组，包括针对炭疽芽孢杆菌、土拉弗朗西斯菌、霍乱弧菌、鼻疽伯克霍尔德菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、鹦鹉热衣原体和q热立克次体的保守序列依次设计的引物探针组。经检测9种重要细菌检测体系的灵敏度均可以达到100copy/反应以下。

21、本发明还将所述引物探针组固化到微流控芯片上，将含上述9种致病细菌的阳性质粒的大肠杆菌进行检测，微流控芯片检测9种重要细菌的ct值均小于40，说明该芯片可用于这9种生物威胁病原的检测；利用上述9种灭活病原进行检测，结果显示芯片能够准确检测出病原种类，无交叉反应。

技术特征：

1.一种检测9种致病细菌的引物探针组，其特征在于，包括针对炭疽芽孢杆菌(bacillus anthracis)、土拉弗朗西斯菌(francisella tularensis)、霍乱弧菌(vibriocholerae)、鼻疽伯克霍尔德菌(burkholderia mallei)、类鼻疽伯克霍尔德菌(burkholderiapseudomallei)、鼠疫耶尔森菌(yersiniapestis)、布鲁菌(brucella)、鹦鹉热衣原体(chlamydiapsittaci)和q热立克次体(coxiella burnetii)的保守序列依次设计的引物探针组。

2.根据权利要求1所述引物探针组，其特征在于，所述q热立克次体、鹦鹉热衣原体、鼠疫耶尔森菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、布鲁菌、炭疽芽孢杆菌、鼻疽伯克霍尔德菌、土拉弗朗西斯菌和霍乱弧菌的保守序列的核苷酸序列依次如seq id no.28～seq id no.36所示。

3.根据权利要求1或2所述引物探针组，其特征在于，针对所述q热立克次体设计的引物探针组的核苷酸序列如seq id no.1～seq id no.3所示；

4.根据权利要求3所述引物探针组，其特征在于，在每条探针的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。

5.权利要求1～4任一项所述引物探针组在制备检测9种致病细菌的工具中的应用。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述工具包括微流控芯片。

7.一种同时检测9种致病细菌的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括权利要求1～4任一项所述引物探针组。

8.根据权利要求7所述微流控芯片，其特征在于，所述引物探针组固化在微流控芯片中。

9.根据权利要求7所述微流控芯片，其特征在于，当利用所述微流控芯片进行所述9种致病细菌的检测时，ct值大于40认定为阴性，ct值为40时需重新检测，0＜ct值＜40时认定为阳性。

10.根据权利要求7所述微流控芯片，其特征在于，每一种致病细菌的引物探针组的固化，包括以下步骤：将上游引物、下游引物和探针共同溶解到无菌水中，得引物探针液；将溶解后的琼脂糖加入所述引物探针液中，混合均匀，得混合液；利用所述混合液点样反应孔，冻干后进行芯片封装。

技术总结
本发明公开了一种检测9种致病细菌的引物探针组和微流控芯片，属于生物检测技术领域。本发明提供了针对炭疽芽孢杆菌、土拉弗朗西斯菌、霍乱弧菌、鼻疽伯克霍尔德菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、鹦鹉热衣原体和Q热立克次体的引物探针组。经检测9种重要细菌检测体系的灵敏度均可以达到100copy/反应以下。本发明还将所述引物探针组固化到微流控芯片上，对上述9种致病细菌进行检测，Ct值均小于40，能够准确检测出病原种类，无交叉反应。

技术研发人员：刘鹏,李倩,律清宇,黄文华,江华,姜永强
受保护的技术使用者：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15