一种水稻抗穗发芽基因Sdr4的功能标记引物及其应用的制作方法

本发明属于水稻分子育种，具体涉及一种水稻抗穗发芽基因sdr4的功能标记引物及其应用。

背景技术：

1、种子休眠是高等植物为避免其种子在不利条件下生根发芽而产生的一种延迟发芽的机制，可以调节种子在适宜的时间和空间分布下萌发。穗发芽(pre-harvestsprouting)是禾谷类作物在收获前直接在穗上发芽的现象，是一个全球性农业生产问题。野生植物种子的休眠通常较深且个体间差异大，而农业生产要求种子出芽整齐，这势必导致在植物驯化的过程中偏好那些种子休眠期短的性状，因此现代禾谷类作物相较其野生祖先更容易发生穗发芽。近年来随着全球气候变化日益极端，收获期持续阴雨导致的穗发芽现象愈加频繁。2016年9-10月苏浙皖沪地区遭遇多次连续阴雨造成粳稻品种普遍出现不同程度的穗发芽早熟品种甚至出现二次穗发芽高峰；2023年5月我国北方地区遭遇“烂场雨”，导致成熟的小麦穗发芽、霉变，小麦受灾面积达到2790万亩。这些情况预示谷物抗穗发芽育种将扮演更加重要的作用。

2、公开报道显示kasalath和nipponbare间存在一个同源等位基因sdr4(os07g0585700)，sdr4-n基因的编码区第508bp-525bp存在一个18个碱基的重复(功能多态区域)，是导致水稻更容易发生穗发芽的原因，同时sdr4-k基因可在不影响主要农艺性状的情况下增强水稻白粉病的抗性，并且与rc、sd1基因在休眠性状上存在加性效应，这使得sdr4基因成为具有穗发芽抗性和抗白粉病的双重潜力。有研究根据sdr4的功能区域设计了sdr4基因的切割扩增多态性序列(caps)功能标记，该标记可以区分sdr4-k和sdr4-n两种基因型。但切割扩增多态性序列(caps)技术需利用限制酶酶切pcr扩增片段再电泳分离以检测多态性，存在pcr扩增片段必须含有酶切位点、限制性内切酶价格高昂、过程繁琐等缺点，和育种所需的快速、高通量、低成本的要求不符。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种水稻抗穗发芽基因sdr4的功能标记引物及其应用，本发明的水稻抗穗发芽基因sdr4的功能标记引物可以快速、准确、低成本、高通量地检测水稻sdr4基因型，有利于该基因在水稻穗发芽抗性分子育种中的高效应用。

2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种水稻抗穗发芽基因sdr4的功能标记引物，所述水稻抗穗发芽基因sdr4的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述基因sdr4的功能标记位于sdr4-n基因的编码区第508bp-525bp处存在的18个碱基重复的功能多态区域；所述sdr4基因的功能标记引物由1条通用引物和2条特异性引物组成；

3、所述通用引物为sdr4cr，核苷酸序列如seq id no.2所示；

4、所述特异性引物包括sdr4nr和sdr4kr；所述特异性引物sdr4nr的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述特异性引物sdr4kr的核苷酸序列如seq id no.4所示。

5、优选地，所述特异性引物sdr4nr与穗发芽基因sdr4-n匹配。

6、优选地，所述特异性引物sdr4kr则与抗穗发芽基因sdr4-k匹配。

7、本发明还提供了一种利用所述水稻抗穗发芽基因sdr4的功能标记引物检测水稻抗穗发芽基因sdr4基因型的方法，该方法包括以下步骤：

8、s1、提取待测水稻叶片基因组dna；

9、s2、以s1提取的水稻叶片基因组dna为模板，用所述引物进行pcr扩增，得到pcr产物；

10、s3、将s2得到的pcr产物在4％的聚丙烯酰胺胶上分离后进行银染，然后在naoh的甲醛溶液中显色，带型在照胶仪上拍照保存；若pcr产物条带只有一条且长度为191bp，则待测水稻为纯合的抗穗发芽sdr4-k基因型；若pcr产物条带只有一条且长度为201bp，则待测水稻为纯合的穗发芽sdr4-n基因型；若有两条pcr产物且大小分别为191bp和201bp，则待测水稻中为sdr4杂合基因型。

11、优选地，s2所述pcr扩增反应体系为：2μl 10×buffer、0.2μl 10mmol/ldntp、0.4μl 5μmol/l特异性引物sdr4kr、0.4μl 5μmol/l特异性引物sdr4nr、0.4μl 5μmol/l通用引物sdr4cr、1μl待测水稻基因组dna、0.15μl 5u/μl taq dna聚合酶、ddh2o补足至20μl；所述pcr扩增反应条件为：94℃2min，98℃10s，60℃30s，68℃30s，扩增35个循环，最后68℃终延伸1min。

12、优选地，s3所述naoh的甲醛溶液配制方法为：在100ml浓度为0.5mol/l的naoh水溶液中加入0.5ml甲醛。

13、本发明还提供了一种所述水稻抗穗发芽基因sdr4的功能标记引物的应用，所述水稻抗穗发芽基因sdr4的功能标记引物可用于鉴定抗穗发芽水稻植株、种质资源筛选和水稻抗穗发芽分子标记辅助育种。

14、本发明与现有技术相比具有以下优点：

15、1、前人根据sdr4的功能区域设计了切割扩增多态性序列(caps)功能标记，该标记需利用限制酶酶切pcr扩增片段再电泳分离以检测多态性，存在pcr扩增片段必须含有酶切位点、限制性内切酶价格高昂、过程繁琐等缺点。本发明提供了一种水稻抗穗发芽基因sdr4的功能标记引物，仅需普通taq酶、常规pcr仪器和聚丙烯酰胺凝胶电泳即可实现鉴定等位基因型，流程相对简单、应用门槛低、成本低。

16、2、本发明通过不同等位基因电泳条带差异，定性鉴定有无抗穗发芽基因，且不同等位基因鉴定简便，可以高通量应用于水稻育种。

17、3、本发明开发的功能标记引物根据穗发芽基因sdr4基因的功能区域设计，与该抗性基因共分离，通过1次pcr扩增就可以区分sdr4-k纯合、sdr4-n纯合和杂合3种基因型，能准确鉴定sdr4基因的不同基因型，可用于抗穗发芽水稻植株鉴定、种质资源筛选和抗穗发芽sdr4基因的分子标记辅助选择育种。

18、下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

技术特征：

1.一种水稻抗穗发芽基因sdr4的功能标记引物，其特征在于，所述水稻抗穗发芽基因sdr4的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述基因sdr4的功能标记位于sdr4-n基因的编码区第508bp-525bp处存在的18个碱基重复的功能多态区域；所述sdr4基因的功能标记引物由1条通用引物和2条特异性引物组成；

2.根据权利要求1所述的一种水稻抗穗发芽基因sdr4的功能标记引物，其特征在于，所述特异性引物sdr4nr与穗发芽基因sdr4-n匹配。

3.根据权利要求1所述的一种水稻抗穗发芽基因sdr4的功能标记引物，其特征在于，所述特异性引物sdr4kr则与抗穗发芽基因sdr4-k匹配。

4.一种利用权利要求1所述的水稻抗穗发芽基因sdr4的功能标记引物检测水稻抗穗发芽基因sdr4基因型的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的一种检测水稻抗穗发芽基因sdr4基因型的方法，其特征在于，s2所述pcr扩增反应体系为：2μl 10×buffer、0.2μl10mmol/l dntp、0.4μl 5μmol/l特异性引物sdr4kr、0.4μl 5μmol/l特异性引物sdr4nr、0.4μl 5μmol/l通用引物sdr4cr、1μl待测水稻基因组dna、0.15μl 5u/μl taq dna聚合酶、ddh2o补足至20μl；所述pcr扩增反应条件为：94℃2min，98℃10s，60℃30s，68℃30s，扩增35个循环，最后68℃终延伸1min。

6.根据权利要求4所述的一种检测水稻抗穗发芽基因sdr4基因型的方法，其特征在于，s3所述naoh的甲醛溶液配制方法为：在100ml浓度为0.5mol/l的naoh水溶液中加入0.5ml甲醛。

7.一种如权利要求1所述水稻抗穗发芽基因sdr4的功能标记引物的应用，其特征在于，所述水稻抗穗发芽基因sdr4的功能标记引物可用于鉴定抗穗发芽水稻植株、种质资源筛选和水稻抗穗发芽分子标记辅助育种。

技术总结
本发明提供了一种水稻抗穗发芽基因Sdr4的功能标记引物，所述水稻抗穗发芽基因Sdr4的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述基因Sdr4的功能标记位于Sdr4‑n基因的编码区第508bp‑525bp处存在的18个碱基重复的功能多态区域；所述Sdr4基因的功能标记引物由1条通用引物和2条特异性引物组成；所述通用引物为Sdr4CR，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述特异性引物包括Sdr4NR和Sdr4KR，核苷酸序列如SEQ ID NO.3和4所示。本发明还提供了一种利用所述功能标记引物检测水稻抗穗发芽基因Sdr4基因型的方法，该方法可以快速、准确、低成本、高通量地检测水稻Sdr4基因型。本发明的水稻抗穗发芽基因Sdr4的功能标记引物可用于鉴定抗穗发芽水稻植株、种质资源筛选和水稻抗穗发芽分子标记辅助育种。

技术研发人员：郑嘉汉,李忠金,黄奇,冯忠平,赵锦祥,郑国源,陈丽萍,何琴玲
受保护的技术使用者：湖州市农业科学研究院（湖州市农业科技发展中心）
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15