一种高产D-甘露糖的嗜甲烷工程菌及其构建方法

本发明属于工业生物，特别涉及一种高产d-甘露糖的嗜甲烷工程菌及其构建方法。

背景技术：

1、d-甘露糖是一种天然的低热量生物活性单糖，已广泛应用于食品、医药、饲料等领域。d-甘露糖具有益生元作用，促进抗炎和抗炎细胞因子的表达，也可用作生产维生素、抗肿瘤剂和免疫刺激剂的起始原料。另外，d-甘露糖是银耳多糖的前体物质，银耳多糖不但具有优异的提高人体免疫机能、抗病毒、降血糖等生理作用，而且具有超强的保水性和很好的成膜性，作为天然保湿剂应用在化妆品领域受到广泛的重视。目前，甘露糖及其衍生物在保健食品、功能食品、化妆品、生物医药等行业受到广泛关注，其需求量不断扩大。

2、目前，d-甘露糖的制备方法主要包括：提取法、化学转化法和微生物酶转化法。提取法主要从水果和植物等原料中的甘露糖直接提取；化学转化法则是以钼酸盐作为催化剂，在酸性高温高压下将葡萄糖异构化为d-甘露糖；酶转化法是通过异构酶直接将葡萄糖或果糖转化为d-甘露糖。由于能耗高、反应条件苛刻、易形成副产物、下游纯化困难等问题，提取法和化学转化法的应用均具有局限性，不能满足工业要求。与提取法和化学转化法不同，微生物酶转化法具有反应条件温和、反应过程可控、副反应少、环境友好等许多优点。

3、由于微生物具有生长速度快、周期短、生长条件温和、代谢过程简单和分布广泛等优点，所以微生物发酵法生产d-甘露糖不受空间、环境和资源的限制，具有成本低、无化学残留和产量高等显著优点，是生产医药及食品级d-甘露糖的一条理想途径。但是微生物发酵法制备d-甘露糖的产量还远不能满足生产需求，产量及生产效率亟待提高。吴昊等人发表《wu hao,huang jia-wei,etc.one-pot production of d-mannose from d-glucose byrecombinant co-expressing escherichia coli cells[j].microbiology china,2020,47(7):2151-2160.》，其通过重组大肠杆菌生产d-甘露糖，但是在最佳反应条件下，也仅可转化100g/l的d-葡萄糖产生13.8g/l的d-甘露糖。

技术实现思路

1、为解决上述现有技术存在的问题，本发明提供一种高产d-甘露糖的嗜甲烷工程菌及其构建方法，通过代谢工程改造实现了d-甘露糖异构酶mi这一异源基因的体内表达和己糖激酶hk与磷酸葡萄糖异构酶pgi内源基因的过表达，有效提高了利用甲烷或甲醇合成d-甘露糖的得率和效率，并将其应用在d-甘露糖的生产中，实现嗜甲烷菌合成d-甘露糖的过程强化和高产。

2、为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

3、一种高产d-甘露糖的嗜甲烷工程菌，包括在宿主菌中导入的外源d-甘露糖异构酶mi，以及在宿主菌中过表达的内源己糖激酶hk和磷酸葡萄糖异构酶pgi。

4、所述宿主菌为产糖原嗜甲烷菌(alkalicoccus glycogenes)wonf2802宿主菌，该菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏菌号cgmcc no.xyz。

5、所述d-甘露糖异构酶mi来源于恶臭假单胞菌pseudomonas putida sk27.016，其核苷酸序列如序列表seq id no.1所示。

6、所述己糖激酶hk和磷酸葡萄糖异构酶pgi均来源于嗜甲烷菌wonf2802；基因hk的核苷酸序列如序列表seq id no.2所示；所述基因pgi的核苷酸序列如序列表seq id no.3所示。

7、所述的高产d-甘露糖的嗜甲烷基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

8、(1)将基因hk和pgi按照ptac-hk-pgi的顺序串联得到ptac-hp片段，利用基因编辑手段，将嗜甲烷菌wonf2802上的glga1基因用ptac-hp替换，得到嗜甲烷工程菌菌株gan1；

9、(2)将外源基因mi与质粒pawp89相连构建重组质粒pawp89-mi，然后转入菌株gan1中，得到产物嗜甲烷工程菌菌株gan2。

10、相对于现有技术，本发明有益效果体现在：

11、1.本发明提供了一种高产d-甘露糖的嗜甲烷工程菌，通过导入异源基因d-甘露糖异构酶基因，重构了d-甘露糖的异源合成路径，提高了以甲烷或甲醇为碳源合成d-甘露糖的产量。

12、2.本发明提供了一种高产d-甘露糖的嗜甲烷工程菌，通过过表达内源基因己糖激酶hk和磷酸葡萄糖异构酶pgi，强化了d-果糖的内源合成路径，提高了以甲烷或甲醇为碳源合成d-甘露糖的产量。

13、3.本发明提供了一种高产d-甘露糖的嗜甲烷工程菌应用，提高了以甲烷或甲醇为碳源合成d-甘露糖的产量，d-甘露糖产量达到20g/l以上，为利用一碳原料(如甲烷、甲醇)生产d-甘露糖提供新的路径，实现了d-甘露糖的高效、低碳生物合成。

技术特征：

1.一种高产d-甘露糖的嗜甲烷工程菌，其特征在于，包括在宿主菌中导入的外源d-甘露糖异构酶mi，以及在宿主菌中过表达的内源己糖激酶hk和磷酸葡萄糖异构酶pgi。

2.根据权利要求书1所述的一种高产d-甘露糖的嗜甲烷工程菌，其特征在于，所述宿主菌为产糖原嗜甲烷菌(alkalicoccusglycogenes)wonf2802宿主菌，该菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏菌号cgmcc no.xyz。

3.根据权利要求书1所述的一种高产d-甘露糖的嗜甲烷工程菌，其特征在于，所述d-甘露糖异构酶mi来源于恶臭假单胞菌pseudomonasputida sk27.016，其核苷酸序列如序列表seq id no.1所示。

4.根据权利要求书1所述的一种高产d-甘露糖的嗜甲烷工程菌，其特征在于，所述己糖激酶hk和磷酸葡萄糖异构酶pgi均来源于嗜甲烷菌wonf2802；基因hk的核苷酸序列如序列表seq id no.2所示；所述基因pgi的核苷酸序列如序列表seq id no.3所示。

5.根据权利要求书1-5任意所述的一种高产d-甘露糖的嗜甲烷工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

技术总结
一种高产D‑甘露糖的嗜甲烷工程菌及其构建方法，在宿主菌中导入D‑甘露糖异构酶MI；过表达己糖激酶HK和磷酸葡萄糖异构酶PGI；通过代谢工程改造实现了D‑甘露糖异构酶MI这一异源基因的体内表达和己糖激酶HK与磷酸葡萄糖异构酶PGI内源基因的过表达，有效提高了利用甲烷或甲醇合成D‑甘露糖的得率和效率，并将其应用在D‑甘露糖的生产中，实现嗜甲烷菌合成D‑甘露糖的过程强化和高产；本发明为D‑甘露糖的商业化生产提供一种低碳生物合成新途径，具有很好的工业应用前景。

技术研发人员：费强,吴晶,范代娣,傅容湛
受保护的技术使用者：西安交通大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15