一种提高细胞增殖倍数的外周血自体NK细胞培养基以及体外培养方法与流程

本发明属于nk细胞培养，涉及一种提高细胞增殖倍数的外周血自体nk细胞培养基以及体外培养方法。

背景技术：

1、自然杀伤细胞(natural killer cell，nk细胞)是淋巴细胞的一个亚群，是人体固有免疫的重要组成部分，也是抵御病毒感染和肿瘤细胞的第一道防线。nk细胞无须抗原的预先刺激与活化即能够直接杀伤被病毒感染的自身细胞或者肿瘤细胞，因此称为自然杀伤细胞。

2、nk细胞可以自发发挥作用，而无需事先致敏。它们在细胞触发时快速产生ifn-γ和tnf-α的能力，导致对致癌转化的早期反应。因此，其对肿瘤细胞的即时干预，包括其促进炎症发生的作用，与它们积极参与肿瘤的免疫监测有关。

3、现在有许多细胞免疫疗法是从外周血单个核细胞(pbmc)中提取nk细胞，并将其在体外大量扩增后用于肿瘤患者回输，但是不使用饲养细胞难以在体外扩增足够数量的nk细胞。然而，一些研究人员认为，用饲养细胞扩增的nk细胞这项技术是有问题的。例如，有人担心nk细胞的培养时间要长达14～21天，在输注后，由于已经脱离了饲养细胞对nk细胞提供培养的最佳环境，导致nk细胞的体内存活期缩短和细胞毒作用降低。为此，研究人员发展了纯因子的nk培养法，剔除了饲养细胞，但随之出现了nk细胞增殖减缓、数量不足的缺点。

4、为解决上述问题，本发明提出了一种刺激nk细胞增殖、提高nk细胞增殖倍数的培养方法，以解决nk细胞体外培养数量不足的问题。

5、胱抑素c(cystatin c，cys c)，又名γ2痕迹碱性蛋白或后γ球蛋白，是半胱氨酸蛋白酶抑制剂蛋白质中的一种，cys c可在体内以恒定速度产生，并存在于各种体液之中，尤以脑脊液和精浆中含量为高，临床上用于治疗肾脏疾病。胱抑素c可抑制细胞凋亡、促进细胞增殖。槲皮素是一种天然黄酮类化合物，具有抗氧化活性，槲皮素作为抗凋亡、抗氧化剂可对多种器官损伤起到保护作用，可帮助细胞抵抗体内外环境压力。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有外周血自体nk细胞培养的不足之处，提供一种提高细胞增殖倍数的外周血自体nk细胞培养基以及体外培养方法。可以提高外周血自体nk体外培养增殖倍数。

2、为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种提高细胞增殖倍数的外周血自体nk细胞培养基，包括基础培养基及其添加物，所述基础培养基为无血清免疫细胞培养基(包括但不限于corning 581培养基等)，所述添加物包括：cd16抗体、胱抑素c、槲皮素、自体血浆、il-2、il-15、及il-21。

4、所述无血清免疫细胞培养基在所述nk细胞培养基中的体积百分数为90～99％。

5、所述自体血浆在所述nk细胞培养基中的体积百分数为1～10％。

6、优选地，其他各添加物在上述nk细胞培养基中的占比为：

7、

8、本发明还提供了一种高纯度的外周血自体nk细胞体外扩增方法，包含以下技术步骤：

9、(1)应用淋巴细胞分离液从外周血中分离单个核细胞(pbmc)；

10、(2)将分离的单个核细胞加入到培养基a中培养3天，培养基a为添加有cd16抗体、胱抑素c、槲皮素、il-2、il-15、il-21及自体血浆的无血清免疫细胞培养基；

11、(3)第3天开始，每2天补充一次培养基b进行培养，培养基b为添加有胱抑素c、槲皮素、il-2、il-15、il-21及自体血浆的无血清免疫细胞培养基；

12、(4)第14天收获细胞。

13、优选地，步骤(2)中所述培养基a中含有50ng/mlcd16抗体、100ng/ml胱抑素c、100ng/ml槲皮素、100ng/ml的il-2、50ng/ml的il-15、50ng/ml的il-21、10％自体血浆及90％v/v的无血清免疫细胞培养基。

14、优选地，步骤(3)中所述培养基b中含有100ng/ml胱抑素c、100ng/ml槲皮素、100ng/ml的il-2、50ng/ml的il-15、50ng/ml的il-21、5％自体血浆及95％v/v的无血清免疫细胞培养基。

15、优选地，步骤(1)应用密度梯度离心法分离pbmc，并采用56℃热灭活自体血浆。

16、优选地，步骤(2)—步骤(3)中nk细胞均在37℃、5％co2培养箱中静置培养。

17、优选地，步骤(2)中，用培养基a将细胞密度调整为2×106/ml。

18、优选地，步骤(3)中，如果细胞密度>1×106/ml，用培养基b将细胞密度调整至1×106/ml。

19、本发明创造性地在nk细胞体外培养过程中引入胱抑素c和槲皮素，二者具有协同作用，可提高nk细胞增殖倍数，快速实现nk细胞的大量扩增，获得的nk细胞数量多、纯度高、活率强，具有较好的临床应用价值。

技术特征：

1.一种高纯度的外周血自体nk细胞培养基，其特征在于，包括基础培养基及其添加物，所述基础培养基为无血清免疫细胞培养基，所述添加物包括：cd16抗体、胱抑素c、槲皮素、自体血浆、il-2、il-15、及il-21。

2.根据权利要求1所述的一种高纯度的外周血自体nk细胞培养基，其特征在于，所述无血清免疫细胞培养基在所述高纯度的外周血自体nk细胞培养基中的体积百分数为90-99％。

3.根据权利要求1所述的一种高纯度的外周血自体nk细胞培养基，其特征在于，各添加物在所述高纯度的外周血自体nk细胞培养基中的占比为：

4.一种高纯度的外周血自体nk细胞体外扩增方法，其特征在于，包含以下技术步骤：

5.根据权利要求4所述的一种高纯度的外周血自体nk细胞体外扩增方法，其特征在于，所述培养基a中中含有50ng/mlcd16抗体、100ng/ml胱抑素c、100ng/ml槲皮素、100ng/ml的il-2、50ng/ml的il-15、50ng/ml的il-21、10％自体血浆及90％v/v的无血清免疫细胞培养基。

6.根据权利要求4所述的一种高纯度的外周血自体nk细胞体外扩增方法，其特征在于，所述培养基b中含有100ng/ml胱抑素c、100ng/ml槲皮素、100ng/ml的il-2、50ng/ml的il-15、50ng/ml的il-21、5％自体血浆及95％v/v的无血清免疫细胞培养基。

7.根据权利要求4所述的一种高纯度的外周血自体nk细胞体外扩增方法，其特征在于，步骤(1)应用密度梯度离心法分离pbmc，并采用56℃热灭活自体血浆。

8.根据权利要求4所述的一种高纯度的外周血自体nk细胞体外扩增方法，其特征在于，步骤(2)—(3)中nk细胞均在37℃、5％co2培养箱中静置培养。

9.根据权利要求4所述的一种高纯度的外周血自体nk细胞体外扩增方法，其特征在于，步骤(2)中，用培养基a将细胞密度调整为2×106/ml。

10.根据权利要求4所述的一种高纯度的外周血自体nk细胞体外扩增方法，其特征在于，步骤(3)中，如果细胞密度>1×106/ml，用培养基b将细胞密度调整至1×106/ml。

技术总结
本发明公开了一种提高细胞增殖倍数的外周血自体NK细胞培养基以及体外培养方法。通过淋巴细胞分离液从外周血中分离单个核细胞，将分离的单个核细胞加入到含CD16抗体、胱抑素C、槲皮素、IL‑2、IL‑15、IL‑21及自体血浆的无血清免疫细胞培养基中培养3天；之后用含胱抑素C、槲皮素、IL‑2、IL‑15、IL‑21及自体血浆的无血清免疫细胞培养基继续培养至第13天，第14天即可收获细胞，所收获的NK细胞增殖倍数、细胞活率、细胞纯度均高于现有方法。本发明创造性地在NK细胞培养过程中引入胱抑素C、槲皮素，用胱抑素C抑制NK细胞凋亡，促进细胞增殖；用槲皮素协助NK细胞抗氧化应激、抵抗体外培养环境压力，促进细胞增殖；并协同IL‑2、IL15、IL21促进NK细胞增殖，能够克服现有外周血自体NK细胞体外培养的不足之处，可以提高外周血自体NK细胞体外培养增殖倍数、细胞活率、细胞纯度，具有较高的临床应用价值。

技术研发人员：臧伟仲,戴国胜,阿卡尔·阿尔普
受保护的技术使用者：方舟启源（北京）生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/1