柑橘木虱唾液蛋白DcS4、其编码基因及其应用

本发明申请涉及生物基因工程，具体涉及一种柑橘木虱唾液蛋白dcs4、其编码基因及其应用。

背景技术：

1、脐橙是在我国南方广泛种植、经济地位最高的果树，其产量居于世界首位。柑橘黄龙病被称为柑橘癌症，其对柑橘经济产生了很大的影响。而传播黄龙病的最主要的虫媒是柑橘木虱（ diaphorinacitri），如不加以防治，将会严重威胁当地的柑橘产业。柑橘木虱是一种臭名昭著的刺吸式害虫，其所携带的柑橘黄龙病菌（ candidatusliberibacterasiaticus, clas）导致柑橘属植物患上黄龙病（huanglongbing,hlb）。柑橘木虱口器为刺吸式口器，在吸取植物汁液时，侵染植物，传播病菌，影响植物发育甚至造成植物萎蔫、枯死，柑橘木虱目前的防治方法包括农业防治、物理防治、化学防治、生物防治。其中施用化学农药进行防治是当前主要的防治手段。但是化学防治也具有一定的局限性，比如化学防治的方式主要采用的农药如吡虫啉、高效氯氰菊酯等，不仅会增加柑橘木虱的抗药性，同时在柑橘表面残留的农药也会危害人体健康。

2、鉴于柑橘木虱对柑橘生产造成的巨大损失，且现有种质资源中缺乏有效的抗木虱基因，常规抗木虱育种也难以在短期内奏效。而利用rnai技术对柑橘木虱进行分子防治是新的技术途径，对于保障我国柑橘生产具有重要的意义。rnai靶标基因是利用rnai技术提高植物抗虫性能的基础。然而现有高效rnai靶标基因匮乏，特别是柑橘木虱取食相关的基因。

3、公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本发明总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成本领域技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

1、本发明申请的目的在于提供一种柑橘木虱唾液蛋白dcs4、其编码基因及应用，旨在解决柑橘木虱和/或柑橘黄龙病难以进行高效的无害化防治的技术问题。

2、为解决上述技术问题，本申请采用如下技术方案：

3、筛选得到一种柑橘木虱唾液蛋白dcs4，长度为230个氨基酸，其氨基酸序列如seqid no. 1所示。

4、克隆得到编码所述柑橘木虱唾液蛋白dcs4的 dcs4基因，长度为693 bp，其核苷酸序列如seq id no. 2所示。

5、基于所述柑橘木虱 dcs4基因核苷酸序列设计合成了一个dsrna片段，其是由如seqid no.3所示的核苷酸和其反向互补序列的核苷酸组成的双链rna。

6、所述柑橘木虱 dcs4基因或所述dcs4蛋白能够有效应用于柑橘木虱和/或黄龙病的防治中，或者用于制备防治柑橘木虱的制剂/产品。

7、基于所述 dcs4序列设计dsrna或其片段，可使柑橘木虱摄入dsrna或其片段影响其取食能力及存活能力，从而起到防治柑橘木虱的作用。

8、上述编码基因、dsrna，含有 dcs4基因及其同源基因的重组表达载体、超表达载体、干扰载体、重组病毒、转基因细胞系、转基因植物或组织、重组菌、重组基因表达盒及其应用，均属于本发明构思范畴。

9、含 dcs4基因的重组表达载体包括双元农杆菌载体，病毒载体，细菌表达载体及酵母表达载体等。含 dcs4基因的载体在构建过程中，可以单独或者多个组合使用诱导型、组成型、增强型、组织特异型等；载体可以包括抗生素或抗化学试剂的抗性筛选标记，也可以含有产生颜色变化的酶，比如gus、或者红色或绿色荧光蛋白等。

10、抑制 dcs4基因的表达为本发明的构思范围，本发明构思还涉及用于抑制 dcs4基因的表达的物质在制备产品中的应用。所述产品功能为抑制木虱对植物的取食和/或致病；用于抑制 dcs4基因表达的物质具体可以为抑制 dcs4基因表达的dsrna，干扰载体，以及病毒载体等。

11、本申请通过基因沉默，将 dcs4dsrna导入木虱体内，测定了 dcs4基因沉默对柑橘木虱生存的影响，实验结果表明 dcs4基因经dsrna处理沉默10天后，柑橘木虱的死亡率与对照gfp dsrna相比提高了47%，表明该基因在木虱生存过程中发挥重要作用，可作为植物抗柑橘木虱的靶标基因。本申请对于柑橘木虱取食机理研究以及抗木虱植物的培育具有重大价值。

12、含有如下活性成分中的至少一种的产品也属于本申请的保护范围：

13、a、所述dsrna；

14、b、重组表达载体、超表达载体、干扰载体、重组病毒、转基因细胞系、重组菌或重组基因表达盒；

15、所述产品具有如下功能中的至少一种：

16、①防治柑橘木虱；

17、②降低柑橘木虱存活率；

18、③抑制柑橘木虱 dcs4基因的表达。

19、本申请实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

20、1. 筛选得到一种柑橘木虱唾液蛋白dcs4，该蛋白基因与柑橘木虱的取食和存活率相关，可以利用该蛋白或其编码基因进行生物防控。

21、2. 基于 dcs4序列合成的dsrna或其片段，可以显著沉默柑橘木虱 dcs4基因的表达，进而降低其存活率；该基因在柑橘木虱生物防治中显示很好的应用前景。

技术特征：

1.一种柑橘木虱唾液蛋白dcs4，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no. 1所示。

2.一种柑橘木虱dcs4基因，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no. 2所示。

3.抑制权利要求2所述柑橘木虱dcs4基因表达的dsrna。

4.根据权利要求3所述的dsrna，其特征在于，所述dsrna是由如seq id no. 3所示的核苷酸和其反向互补序列的核苷酸组成的双链rna。

5.含有权利要求2所述dcs4基因的重组表达载体、超表达载体、干扰载体、重组病毒、转基因细胞系、重组菌或重组基因表达盒。

6.权利要求1所述dcs4蛋白、权利要求2所述柑橘木虱dcs4基因、权利要求3所述dsrna或权利要求5所述重组表达载体、超表达载体、干扰载体、重组病毒、转基因细胞系、重组菌或重组基因表达盒在如下（1）～（3）中至少一项的应用：

7.含有如下活性成分中的至少一种的产品：

8.一种防治柑橘木虱的方法，其特征在于，包括如下步骤：

技术总结
本发明申请涉及一种柑橘木虱唾液蛋白DcS4、其编码基因及其应用，旨在解决柑橘木虱难以无害化防治的技术问题，本申请筛选得到一种DcS4蛋白，获取自柑橘木虱的唾液蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码该蛋白的DcS4基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本申请利用dsRNA处理沉默DcS4基因后，柑橘木虱的生存能力及其对寄主柑橘的致病力与对照GFP dsRNA处理组相比均显著降低，表明此基因在木虱的取食和侵染致病过程中具有重要作用，可作为植物抗木虱工程的靶标基因；本申请对于柑橘木虱致病机理研究以及抗木虱植物制备具有重大应用价值。

技术研发人员：喻修道,邝印辉,陈志勤,高立伟
受保护的技术使用者：赣南师范大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/11