一种多对二硫键多肽的合成方法与流程

本发明涉及多肽的合成方法，特别涉及一种多对二硫键多肽的合成方法。

背景技术：

1、二硫键(disulfide bond)是多肽和蛋白质中一种常见的翻译后修饰，对维持多肽空间构象以及某些生物学活性起着重要的作用。现有的许多药物都需要二硫键的存在才具有活性，如：奥曲肽、奈西立肽、去氨加压素、阿托西班等，因此二硫键的氧化方法一直是多肽行业研究的重点。

2、多对二硫键多肽，特别是三对及三对以上的二硫键多肽的合成一直都是多肽合成领域中的技术难点，多个cys位点在二硫键搭桥过程中的错配导致无法确认其目标产物的结构，定位搭桥的方式又受限于其正交保护基的种类，常规方法中n种正交保护基只能合成n对二硫键多肽。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种多对二硫键多肽的合成方法。主要解决二硫键多肽的合成中多个cys位点在二硫键搭桥过程中的错配导致无法确认其目标产物的结构的技术问题。

2、本发明的技术方案如下：一种多对二硫键多肽的合成方法，包括以下步骤：

3、（1）选择半胱氨酸两种正交保护基x和y；

4、（2）采用fmoc固相合成法平行合成两条直链多肽，其中肽a中cys选择{肽a1(y)-3(y), 肽a2(x)-5(x),肽a 4(x)-6(x)}保护，肽b选择{肽b1(x)-3(x), 肽b2(x)-5(x), 肽b4(y)-6(y)}保护；

5、（3）去除保护基x，随机氧化，再去除保护基y，定位氧化，肽a会有三种异构体，即环肽（1-3,2-5,4-6），环肽（1-3,2-4,5-6），环肽（1-3,2-6,4-5）；肽b也有三种异构体，即环肽（1-3,2-5,4-6），环肽（1-2,3-5,4-6），环肽（1-5,2-3,4-6）；

6、（4）利用高效液相色谱定位监测肽a和肽b，两者中保留时间一致的产物即为所需要的正确结构环肽（1-3,2-5,4-6）。

7、步骤（1）中所选取的半胱氨酸正交保护基x和y包括但不限于trt、acm、mmt、tbu或stbu中的一种或多种；优选两种或三种；更优选：选取trt和acm两种正交保护基或选取mmt和acm两种正交保护基或选取stbu/mmt/tbu三种正交保护基。

8、步骤（2）所述保护的保护方式为：肽a选择y保护多肽中一对二硫键的cys，x保护其余4个cys；肽b选择y保护多肽中另一对二硫键的cys，x则保护剩余4个cys。

9、该方法也适用于选择3种正交保护基合成4对二硫键多肽，以此类推，从而实现选择n种正交保护基，合成（n+1）对二硫键多肽。

10、本发明的有益效果：本发明的方法利用n种正交保护基，合成n+1对二硫键的多肽，大大提高了对于一些复杂的多对二硫键多肽的合成可能性，可以广泛应用于一些新型的多对二硫键环肽药物的研发和生产。二硫键错配异构体目前只能依靠酶解后再测序去鉴别其二硫键搭桥位置，但是该方式步骤繁琐成本高，另外酶解还很受限于多肽序列，对于一些特殊序列很难鉴别，通过本方法可以快速确认正确的二硫键搭桥结构并合成得到目标产物。

技术特征：

1.一种多对二硫键多肽的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种多对二硫键多肽的合成方法，其特征在于，步骤（1）中所选取的半胱氨酸正交保护基x和y包括但不限于trt、acm、mmt、tbu或stbu中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的一种多对二硫键多肽的合成方法，其特征在于，步骤（1）中所选取的半胱氨酸正交保护基x和y包括但不限于trt、acm、mmt、tbu或stbu中的两种或三种。

4.根据权利要求3所述的一种多对二硫键多肽的合成方法，其特征在于，步骤（1）中所选取的半胱氨酸正交保护基x和y选取trt和acm两种正交保护基或选取mmt和acm两种正交保护基或选取stbu/mmt/tbu三种正交保护基。

5.根据权利要求1所述的一种多对二硫键多肽的合成方法，其特征在于，所述保护的保护方式为：肽a选择y保护多肽中一对二硫键的cys，x保护其余4个cys；肽b选择y保护多肽中另一对二硫键的cys，x则保护剩余4个cys。

6.根据权利要求1所述的一种多对二硫键多肽的合成方法，其特征在于，该方法也适用于选择3种正交保护基合成4对二硫键多肽，以此类推，从而实现选择n种正交保护基，合成（n+1）对二硫键多肽。

技术总结
本发明公开了一种多对二硫键多肽的合成方法，解决了目前多对二硫键定位氧化的技术难点。本发明主要包括以下步骤：1.选择半胱氨酸两种正交保护基X和Y；2.采用Fmoc固相合成法平行合成两条直链多肽，其中肽A中Cys选择{1(Y)‑3(Y),2(X)‑5(X),4(X)‑6(X)}保护，肽B选择{1(X)‑3(X),2(X)‑5(X),4(Y)‑6(Y)}保护；3.去除保护基X，随机氧化，再去除保护基Y，定位氧化，肽A会有三种异构体，即环肽（1‑3,2‑5,4‑6），（1‑3,2‑4,5‑6），（1‑3,2‑6,4‑5）；肽B也有三种异构体，即环肽（1‑3,2‑5,4‑6），（1‑2,3‑5,4‑6），（1‑5,2‑3,4‑6）；4.利用高效液相色谱定位监测肽A和肽B，两者中保留时间一致的产物即为所需要的正确结构环肽（1‑3,2‑5,4‑6）。

技术研发人员：徐红岩,竺剑峰,韩士永,程庆武,张成桂,奚佳麒,胡琳琳
受保护的技术使用者：吉尔生化（上海）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/1