NtTIFY7基因在调控烟草青枯病抗性中的应用

本发明属于生物领域，涉及nttify7基因在调控烟草青枯病抗性中的应用。

背景技术：

1、烟草是全球范围内广泛种植的经济作物，是研究分子生物学和细胞生物学重要的模式物种，也是新兴的生物反应器。烟草田间生产过程中易受到病虫害侵袭，极大影响烟叶产量和质量。由青枯雷尔氏菌引起的青枯病是烟草大田生产上最为常见的土传细菌病害之一，烟株感染后迅速萎蔫死亡。此外，青枯雷尔氏菌还可侵染50多个科的数百种植物，包括茄科和豆科中的一些重要经济作物，如辣椒、番茄、花生等。鉴定烟草青枯病抗性相关基因，解析其分子机制，是烟草青枯病抗性育种的重要目标，同时能够丰富植物抗青枯病基因资源，具有重要的理论和实践意义。

2、为挖掘青枯病抗性关键位点，qian(qian,wang et al.2013)与lan等人(lan,zheng et al.2014)等人利用青枯病抗源烤烟品种ti448a及其衍生品种岩烟97开展青枯病抗性基因定位工作，分别获得4个和2个青枯病抗性相关位点。随着测序技术的发展，分子标记日益完善，lai等人(lai,ikram et al.2021)基于rad简化基因组测序技术(rad-seq)利用94份烟草品种进行多位点全基因组关联分析，关联到52个与青枯病抗性相关的数量性状核苷酸。然而，目前这些抗性相关位点尚未得到充分解析。此外，科研工作者基于反向遗传学手段鉴定到数个烟草青枯病抗性相关基因。病程相关蛋白广泛与系统获得性抗性相关，广泛参与抵御真菌、细菌以及病毒的入侵。ntpr1a与ntpr-q基因均属于pr家族，在云烟87中分别过表达ntpr1a与ntpr-q可激活sa、et、ja途径防御相关基因的表达，均可明显提高云烟87对青枯病的抗病性(tang,liu et al.2017,liu,liu et al.2019)。锌指蛋白基因家族也被报道参与青枯病抗性。liu y等人(liu,tang et al.2021)鉴定了一个基因ntrnf217，该基因编码含有239个氨基酸的e3泛素连接酶蛋白，可诱导烟草hr反应并调控抗氧化酶的积累和抗性相关基因的转录，过表达该基因可显著降低烟草青枯病病情指数。此外，wrky转录因子也被证实参与青枯病抗性，过表达ntwrky50可引起sa与ja含量的改变，导致抗性相关基因表达被激活，进而调控烟草对青枯病抗性(liu,liu et al.2017)。总的来说，烟草青枯病抗性机制解析工作相对滞后，抗性基因资源相对匮乏。

3、jaz蛋白是茉莉酸信号通路、赤霉素信号通路和ice-cbf信号通路信息交流的核心节点，广泛参与植物响应生物胁迫与非生物胁迫过程。jaz蛋白通过aba和meja信号途径参与植物应对干旱环境。jaz1被证实与e3泛素连接酶互作并被其泛素化，进而调控aba信号途径(koh,joo et al.2023)。open stomata1作为aba信号途径的核心节点，干旱胁迫下与jaz蛋白互作，通过整合aba及ja信号途径，帮助植物抵御干旱胁迫(rao,tian et al.2023)。此外，jaz亚家族还广泛参与植物抵抗病原菌过程。jaz作为ja信号途径的抑制子，其包含的jas结构域是响应ja过程中的主要原因。为探究osjaz8在水稻抗黄单胞菌过程中的作用，shoko等人(yamada,kano et al.2012)发现外源ja处理下，osjaz8通过26s蛋白酶体途径降解，而在水稻中过表达jas缺陷的osjaz8导致水稻对白叶枯病的抗性显著降低。在甘蔗鞭黑粉菌侵染下scjaz6表达水平显著上调，同时在me-ja处理下也观察到同样的趋势；在本氏烟叶片中瞬时过表达scjaz6后，能够抑制病原菌在叶片上的繁殖(liu,sun et al.2017)。jaz还通过与转录因子mycs互作，参与植物免疫反应。例如，jaz蛋白通过靶向mycs转录因子直接调控nacs的表达，进而调节气孔关闭阻止病原菌入侵(gimenez-ibanez,boter etal.2017)。jaz-myc单元可共同调控色氨酸代谢、促进吲哚硫代葡萄糖苷的产生以及er小体的形成，这些次生代谢物以及er小体在植物抗病过程中有重要作用(nakano,yamada etal.2014,hunziker,ghareeb et al.2020,guo,major et al.2022)。

技术实现思路

1、本发明通过在多份抗、感材料中进行荧光定量pcr发现nttify7与烟草青枯病抗性显著相关，沉默nttify7后烟草植株对烟草青枯病抗性显著降低。

2、本发明通过以下技术方案实现：

3、本发明首先在6份对青枯病表现抗、感的烟草品种中对nttify7进行定量验证，并构建了nttify7沉默植株，具体如下：

4、一种青枯菌侵染样品的制备方法，步骤为：于发苗盆内播种，至出苗后移至1/4霍格兰营养液，人工气候室内培养至四叶一心期，接种y45菌液(od600＝0.1)，于接菌后3、9、24及48h取全根系样品。

5、一种构建沉默nttify7烟草的制备方法，步骤为：扩增nttify7编码序列，根据序列信息设计沉默序列，构建trv2介导的vigs载体，经农杆菌转化，侵染本氏烟草，通过qrt-pcr验证沉默效率，获得nttify7沉默植株。

6、经调查比较接菌后抗感材料中nttify7的表达量变化，发现抗青枯病品种与感青枯病品种中nttify7的表达量在接种青枯菌后均显著上调，但其在抗病品种中的上调倍数明显高于感病材料。结果表明，nttify7的表达量与烟草青枯病抗性相关。

7、通过构建nttify7沉默植株，比较nttify7沉默植株与对照材料接种青枯菌后的发病率及表型，发现nttify7沉默植株发病率显著高于对照植株。因此，上述nttify7与青枯病抗性显著相关，其沉默植株系更易感染青枯病。

8、根据上述内容可知，seq no id:1所示的烟草nttify7基因可用于调控烟草青枯病抗性。

9、本发明的有益效果为：

10、本发明分析了6份对青枯病表现抗、感材料的nttify7在接种青枯菌后的表达变化，构建了烟草nttify7沉默植株，分析了nttify7沉默植株的发病率及表型。

11、本发明分析发现，nttify7与烟草青枯病抗性显著相关；沉默nttify7使得烟草对烟草青枯病病原菌的抗性随之降低。

技术特征：

1.seq no id.1所示的烟草nttify7基因在调控烟草青枯病抗性中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于沉默或抑制所述的烟草nttify7基因的表达降低烟草对青枯病抗性。

3.一种降低烟草青枯病抗性的方法，其特征在于沉默或抑制烟草中所述的烟草nttify7基因的表达。

技术总结
本发明公开了NtTIFY7基因在调控烟草青枯病抗性中的应用。本发明提供了利用烟草NtTIFY7基因调节烟草对青枯病病原菌抗性的用途。本发明通过沉默NtTIFY7基因使得烟草对烟草青枯病病原菌的抗性随之降低。本发明证实了NtTIFY7基因在调节烟草青枯病抗性的新用途。

技术研发人员：杨爱国,肖志亮,章慧芬,谢贺,程昌合,耿锐梅,任民,刘正文
受保护的技术使用者：中国农业科学院烟草研究所（中国烟草总公司青州烟草研究所）
技术研发日：
技术公布日：2024/3/27