一种牛胚胎的体外培养液及培养方法与流程

本发明申请涉及牛胚胎的体外培养，具体涉及一种牛胚胎的体外培养液及培养方法。

背景技术：

1、胚胎一般是指怀孕最初两个月内的幼体。囊胚、胚的早期发育和胚胎发育是一个连续过程。在体节时期，三个胚层都发生了变化。外胚层在背部中线凹陷成沟，称神经沟，沟的两岸称神经脊。神经脊逐渐接近、愈合，致使神经演变为纵贯胚体的神经管。神经管和神经脊将来演化为神经系统。内胚层随着胚体卷曲成管状，称原肠，原肠依部位又分为前肠、中肠和后肠，胚胎的体外培养是近些年来的新式培养技术，能够在体外完成胚胎的形成与发育。

2、中国专利公开了（cn108753689b）牛体外受精胚胎培养的方法。该方法包括如下步骤：卵母细胞的采集和体外成熟；体外受精；胚胎体外培养及保存。在体外受精时，成熟的cocs在本发明受精培养液中培养，在胚胎体外培养时，将胚胎周围的颗粒细胞用剥卵针去除干净，放入胚胎培养液中培养，培养完毕后将可用胚胎在冷冻液中液氮冷冻保存。该方法呈现诸多如说明书所述优异技术效果。现如今的胚胎体外培养方法虽然也能够完成胚胎的体外培育，但其内并未设置有专门针对于精液的纯化与获能过程，从而无法提高获取的精子的质量与活性，无法提高受精卵形成的成功率，整体方法的应用效果不佳，为了解决上述问题，亟待需要一种牛胚胎的体外培养液及培养方法。

3、发明申请内容

4、有鉴于此，本发明申请提供一种牛胚胎的体外培养液及培养方法，本发明申请可以实现牛胚胎的稳定培养。

5、为解决上述技术问题，本发明申请提供一种牛胚胎的体外培养液及培养方法，包括如下材料：氯化钠、葡萄糖、链霉素、半乳糖酸钙、胎牛血清、血清白蛋白、海藻糖与培养液基液。

6、作为上述技术方案的进一步描述：

7、所述果氯化钠、葡萄糖、链霉素、半乳糖酸钙、胎牛血清、血清白蛋白、海藻糖与培养液基液的重量份数分别为1-3份、3-5份、1-3份、4-6份、8-10份、7-10份、2-6份与14-20份，其中培养液基液为sof液。

8、本文还公开了一种牛胚胎的体外培养方法，包括如下步骤：

9、s1、从液氮罐中取出一支冻存的牛精液细管，并将其立即置于水体中进行一段时间的水浴；

10、s2、将解冻后的牛精液进行纯化处理；

11、s3、使用吸液器将沉淀在纯化液底层的精液吸取，加入培养箱内，加入体外培养液，向培养箱内通入二氧化碳一段时间；

12、s4、取体外培养的卵母细胞，置于培养箱内，箱内注入s3内获取的牛精液；

13、s5、调节培养箱内的温度及二氧化碳浓度，培养一段时间，且利用卵针去除卵丘细胞；

14、s6、等待一段时间，观察卵裂率；

15、s7、将受精后的卵母细胞取出，对其进行多次清洗；

16、s8、将清洗后的受精卵继续移入培养箱内，注入体外培养液，等待定时换液；

17、s9、等待胚胎发育。

18、作为上述技术方案的进一步描述：

19、所述s1中，从液氮罐中取出一支冻存的牛精液细管，并将其立即置于35-40℃水体中进行2-5min的水浴。

20、作为上述技术方案的进一步描述：

21、所述s2中，将解冻后的牛精液进行纯化处理，具体过程为，使牛精液缓慢流入梯度纯化液中，以2500-2800r/min的速率离心处理13-18min。

22、作为上述技术方案的进一步描述：

23、所述s3中，使用吸液器将沉淀在纯化液底层的精液吸取，加入培养箱内，加入体外培养液，向培养箱内通入二氧化碳15-20min，使牛精子获能。

24、作为上述技术方案的进一步描述：

25、所述s5中，调节培养箱内的温度至38-42℃，调节二氧化碳浓度为5-8％，培养8-11h，且利用卵针去除卵丘细胞。

26、作为上述技术方案的进一步描述：

27、所述s6中，等待2-3天，观察卵裂率。

28、作为上述技术方案的进一步描述：

29、所述s7中，将受精后的卵母细胞取出，对其进行5-8次的清洗。

30、作为上述技术方案的进一步描述：

31、所述s8中，将清洗后的受精卵继续移入培养箱内，注入体外培养液，等待90-100h进行换液。

32、综上所述，与现有技术相比，本申请包括以下至少一种有益技术效果：

33、1、该方法设置有对于牛精液的纯化处理过程，能够将一些无用的或死亡的精子进行去除，从而能够获取最优质的活性最高的精子，同时在后续还设置有专门针对于筛选后的精子的获能过程，从而能够有效提高筛选后精子的活性，为后续的受精奠定了坚实的基础，提高了受精成功率。

34、2、该方法在后续对于培养的受精卵进行处理时，利用卵针去除卵丘细胞，能够有效避免培养过程中受精卵受到污染，提高胚胎发育效果，整体方法实际应用效果好。

技术实现思路

技术特征：

1.一种牛胚胎的体外培养液，其特征在于：包括如下材料：氯化钠、葡萄糖、链霉素、半乳糖酸钙、胎牛血清、血清白蛋白、海藻糖与培养液基液。

2.根据权利要求1所述的一种牛胚胎的体外培养液，其特征在于：所述果氯化钠、葡萄糖、链霉素、半乳糖酸钙、胎牛血清、血清白蛋白、海藻糖与培养液基液的重量份数分别为1-3份、3-5份、1-3份、4-6份、8-10份、7-10份、2-6份与14-20份，其中培养液基液为sof液。

3.一种牛胚胎的体外培养方法，其特征在于：包括如下步骤：

4.根据权利要求3所述的一种牛胚胎的体外培养液的制备方法，其特征在于，所述s1中，从液氮罐中取出一支冻存的牛精液细管，并将其立即置于35-40℃水体中进行2-5min的水浴。

5.根据权利要求3所述的一种牛胚胎的体外培养液的制备方法，其特征在于，所述s2中，将解冻后的牛精液进行纯化处理，具体过程为，使牛精液缓慢流入梯度纯化液中，以2500-2800r/min的速率离心处理13-18min。

6.根据权利要求3所述的一种牛胚胎的体外培养液的制备方法，其特征在于，所述s3中，使用吸液器将沉淀在纯化液底层的精液吸取，加入培养箱内，加入体外培养液，向培养箱内通入二氧化碳15-20min，使牛精子获能。

7.根据权利要求3所述的一种牛胚胎的体外培养液的制备方法，其特征在于，所述s5中，调节培养箱内的温度至38-42℃，调节二氧化碳浓度为5-8％，培养8-11h，且利用卵针去除卵丘细胞。

8.根据权利要求3所述的一种牛胚胎的体外培养液的制备方法，其特征在于，所述s6中，等待2-3天，观察卵裂率。

9.根据权利要求3所述的一种牛胚胎的体外培养液的制备方法，其特征在于，所述s7中，将受精后的卵母细胞取出，对其进行5-8次的清洗。

10.根据权利要求3所述的一种牛胚胎的体外培养液的制备方法，其特征在于，所述s8中，将清洗后的受精卵继续移入培养箱内，注入体外培养液，等待90-100h进行换液。

技术总结
本发明申请提供一种牛胚胎的体外培养液及培养方法，属于牛胚胎的体外培养技术领域，包括如下材料：氯化钠、葡萄糖、链霉素、半乳糖酸钙、胎牛血清、血清白蛋白、海藻糖与培养液基液；本发明申请可以实现牛胚胎的稳定培养，本发明设置有对于牛精液的纯化处理过程，能够将一些无用的或死亡的精子进行去除，从而能够获取最优质的活性最高的精子，同时在后续还设置有专门针对于筛选后的精子的获能过程，从而能够有效提高筛选后精子的活性，为后续的受精奠定了坚实的基础，提高了受精成功率，同时在后续对于培养的受精卵进行处理时，利用卵针去除卵丘细胞，能够有效避免培养过程中受精卵受到污染，提高胚胎发育效果，整体方法实际应用效果好。

技术研发人员：徐美芳,汪聪勇,魏盼辉,段凯,崔文广,韩帅,栗敏杰,吕博博,张亚芳,潘黎明,邱峰,杜鹃,生卫东,陈志楠,李盼,李红婵
受保护的技术使用者：河南省鼎元种牛育种有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15