一种热稳定性提高的褐藻胶裂解酶突变体及其用途的制作方法

本发明涉及生物，更具体而言，涉及一种热稳定性提高的褐藻胶裂解酶的突变体酶。

背景技术：

1、海藻酸钠，又名褐藻酸钠，最初提取自褐藻类生物生成的褐藻胶，在工业中通常由β-d-甘露糖醛酸（β-d-mannuronic acid，m）和α-l-古罗糖醛酸（α-l-guluronic acid，g）通过1,4-糖苷键聚合而成，在食品工业中具有增稠、凝胶、稳定体系等多种用途。褐藻寡糖（alginate oligosaccharide，aos）是一种聚合度为2-10的分子，由褐藻胶分解而成，具有调节人体免疫、抗氧化、抗肿瘤、保护神经系统、促进植物生长、抑菌等多种功能。aos因具有特殊的化学特性和生物特性，在农业、食品、药品、保健品、化妆品、冶金、化工等领域具有潜在、广泛的应用价值。目前，褐藻胶的分解方法包括化学分解法、物理分解法和生物酶法，其中由于通过褐藻胶裂解酶的生物酶法的反应副产物少、耗能低且能生成含有不饱和双键的高生物活性寡糖，具有环保、清洁、条件温和、效率高等优点，其取代物理化学法成为制备aos的主流方法已是必然。

2、迄今为止，尽管国内外学者对褐藻胶裂解酶的来源、分类、酶学性质、酶的结构、酶催化机理等方面作了大量的基础研究，但现有技术中的褐藻胶裂解酶仍存在发酵水平低、酶活力不高、价格昂贵、稳定性差、且不适合大规模使用等问题。国际市场上只有美国sigma公司商业化的褐藻胶裂解酶产品a1603-100mg，酶活力大于10000 u/g，但价格昂贵，且仅以试剂形式出售。

3、 reinekea thalattae来源的褐藻胶裂解酶（reth-alyase）是一种新型的7家族褐藻胶裂解酶（p7 family），其对海藻酸钠有着极高的催化活力，比酶活达756.7 u/mg。同时，该酶对多聚古洛糖醛酸展现出较高的催化活力，这一性质目前在p7家族里面报道的较少。然而，reth-alyase的热稳定性较差，在40℃下保持4 h后的酶活不足20%。

4、因此，本领域仍需要一种具有较高活力同时稳定性较好的褐藻胶裂解酶。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的问题，发明人根据已有褐藻胶裂解酶的晶体结构进行同源建模，分析关键位点氨基酸残基，使用定点突变的方法来源于 reinekea thalattae的褐藻胶裂解酶进行催化效率和热稳定性改造，并选择非保守氨基酸残基进行突变，寻找合适的热稳定性提高的突变体酶，由此完成了本发明。

2、因此，本发明的第一方面提供了一种褐藻胶裂解酶突变体，所述褐藻胶裂解酶来源于 reinekea thalattae，具有seq id no.1所示的氨基酸序列，所述突变体包括在第44位和/或第149位的突变。

3、本发明的第二方面提供了一种基因，其编码根据本发明第一方面的褐藻胶裂解酶突变体。

4、本发明的第三方面提供了一种表达载体，其包含根据本发明第二方面的基因。

5、本发明的第四方面提供了一种表达细胞，其包含根据本发明第二方面的基因或根据本发明第三方面的表达载体。

6、本发明的第五方面提供了一种制备褐藻寡糖的方法，所述方法包括将根据本发明第一方面的褐藻胶裂解酶突变体或根据本发明第四方面的表达细胞添加至含有海藻酸盐反应体系中，进行反应。

7、本发明的第六方面提供了根据本发明第一方面的褐藻胶裂解酶突变体或根据本发明第二方面的基因或根据本发明第三方面的表达载体或根据本发明第四方面的表达细胞在制备包含褐藻寡糖的产品中的用途。

8、本发明包括以下一个或者多个有益效果：

9、本发明提供了来源于 reinekea thalattae的褐藻胶裂解酶的突变体，其稳定性得到了提高，特别是双点突变体s44n/h149d在40℃下保持4 h后的酶活仍能保持在50%以上；在最适催化条件下，本发明的突变体酶催化底物海藻酸钠以生产褐藻寡糖的相对酶活无明显下降，这一发现对于工业化制备褐藻寡糖具有重要的研究和经济价值。

技术特征：

1.一种褐藻胶裂解酶突变体，所述褐藻胶裂解酶来源于reinekea thalattae，具有seqid no.1所示的氨基酸序列，所述突变体包括在第44位和/或第149位的突变。

2.根据权利要求1所述的褐藻胶裂解酶突变体，所述褐藻胶裂解酶突变体包括突变s44n和/或h149d。

3.一种基因，编码权利要求1或2所述的褐藻胶裂解酶突变体。

4.一种表达载体，包含权利要求3所述的基因。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其中所述表达载体为原核表达载体。

6.根据权利要求5所述的表达载体，其中所述原核表达载体是质粒，所述质粒选自pet质粒、duet质粒、pgex质粒、phy300质粒、phy300plk质粒、ppic3k质粒或ppic9k质粒。

7.根据权利要求6所述的表达载体，其中所述pet质粒是pet-22b（+）质粒。

8.一种表达细胞，包含权利要求3所述的基因或者权利要求4-7中任一项所述的表达载体。

9.根据权利要求8所述的表达细胞，其中所述表达细胞是来源于原核生物的细胞，或者来源于真核生物。

10.根据权利要求9所述的表达细胞，其中所述原核生物是大肠杆菌bl21(de3)株。

11.根据权利要求9所述的表达细胞，其中所述真核生物是动物。

12.一种制备褐藻寡糖的方法，所述方法包括将权利要求1或2所述的褐藻胶裂解酶突变体或权利要求8-11中任一项所述的表达细胞添加至含有海藻酸盐的反应体系中，进行反应。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述反应体系的ph值范围为7.5-8.5，所述反应在30-40℃进行。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述反应体系的ph值为8.0，所述反应在35℃进行。

15.权利要求1或2所述的褐藻胶裂解酶突变体或权利要求3所述的基因或权利要求4-7中任一项所述的表达载体或权利要求8-11中任一项所述的表达细胞在制备包含褐藻寡糖的产品中的用途。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，更具体而言，涉及一种热稳定性提高的褐藻胶裂解酶突变体及其用途；本发明提供了一种来源于Reinekea thalattae的褐藻胶裂解酶突变体，其热稳定性相对于野生型得到了提高，在最适催化条件下，本发明的突变体酶催化底物海藻酸钠以生产褐藻寡糖的相对酶活无明显下降，具有重要的工业应用和经济价值。

技术研发人员：刘晓勇,徐炜,张波,张文立,沐万孟,王伶秀
受保护的技术使用者：山东海之宝海洋科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15