一种检测穿山甲东阳病毒的TaqMan荧光定量PCR引物组、试剂盒及方法

本发明属于生物，具体涉及一种检测穿山甲东阳病毒的taqman荧光定量pcr引物组、试剂盒及方法。

背景技术：

1、东阳病毒(dong yang pangolin virus，dypv)是一种新型的包膜rna瘟病毒，其具有高度可变的单链正义rna基因组，包含一个大的开放阅读框(orf)，编码一个长度约为3900个氨基酸的多蛋白。该病毒可能引发亚临床症状或引起一系列临床症状，包括急性腹泻、急性出血性综合征、急性致命性疾病等消耗性疾病典型病症。有研究显示，感染dypv的穿山甲出现肝肺充血、皮肤病变、肝细胞的癞核、脾脏淋巴细胞固缩、肝板坏死和肾小球坏死等病理变化。虽然dypv暂未对我国畜牧业及林业造成严重影响，相关研究及报道也较少，但应对其潜伏感染引起高度重视，避免dypv呈现爆发性流行、危害动物健康造成严重损失。因此，建立一种灵敏、快速、准确的方法来进一步对dypv进行调查、诊断、预防是非常有必要的。

技术实现思路

1、为了克服现有技术存在的缺陷，本发明提供了检测穿山甲东阳病毒的taqman荧光定量pcr引物组、试剂盒及方法，建立一种简便、高效、实用的dna检测方法，该方法可用于dypv快速检测，应用前景广阔。

2、本发明的第一个目的是提供检测穿山甲东阳病毒的taqman荧光定量pcr引物组，包括一对引物f、r和探针p，所述的引物f的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述的引物r的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述的探针p的核苷酸序列如seq id no.3所示，探针p的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

3、优选，所述的荧光报告基团为fam，所述的荧光淬灭基团为bhq1。

4、本发明的第二个目的是提供一种含有所述的检测穿山甲东阳病毒的taqman荧光定量pcr引物组的试剂盒。

5、优选，所述的试剂盒还包括：荧光定量pcr预混液2×taqman universal probemix、阳性对照和阴性对照；所述的阳性对照为含有穿山甲东阳病毒的5'utr基因的重组质粒，所述的阴性对照为ddh2o。

6、本发明还提供所述的检测穿山甲东阳病毒的taqman荧光定量pcr引物组在制备用于检测穿山甲东阳病毒的试剂中的用途，所述的试剂用于检测来自于穿山甲的样本。

7、本发明的第三个目的是提供一种非疾病诊断目的的检测穿山甲东阳病毒的taqman荧光定量pcr方法，包括以下步骤：

8、s1.提取待检样品的rna并反转录为cdna；

9、s2.利用所述的检测穿山甲东阳病毒的taqman荧光定量pcr引物组、以步骤s1获得的cdna为模板进行荧光定量pcr扩增；

10、s3.反应结束后，根据扩增曲线情况判断待检样品中是否含有穿山甲东阳病毒；所述的判断的方法为：如果扩增曲线为典型荧光扩增曲线(有特异性扩增反应)，则待检样品中含有穿山甲东阳病毒；如果扩增曲线无典型荧光扩增曲线，则待检样品中不含有穿山甲东阳病毒。

11、优选，所述的步骤s2的荧光定量pcr扩增的反应体系为20μl，包含：2×taq manuniversal probe mix 10μl、10μm的引物f1.0μl、10μm的引物r1.0μl、10μm的探针p 0.4μl、cdna模板1.0μl，加ddh2o补足至20μl；所述的荧光定量pcr扩增的反应程序为：预变性95℃2min，40个循环：变性95℃15s、退火60℃40s延伸，并在60℃收集荧光信号。

12、本发明具有以下有益效果：

13、本发明以dypv的5'utr基因作为目标基因，该序列高度保守，pcr较易扩增，根据taqman实时荧光pcr的基本原理，针对dypv的5'utr区域为靶基因的特异性区域，设计2条特异性引物和1条探针，建立一种简便、高效、实用的dna检测方法。该方法具有灵敏度高、特异性强、耗时短、高通量等优势。这些优势使得本发明开发的基于taqman荧光定量pcr检测方法方便用于实验室对dypv的快速检测和诊断。

技术特征：

1.检测穿山甲东阳病毒的taqman荧光定量pcr引物组，其特征在于，包括一对引物f、r和探针p，所述的引物f的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述的引物r的核苷酸序列如seqid no.2所示，所述的探针p的核苷酸序列如seq id no.3所示，探针p的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述的荧光报告基团为fam，所述的荧光淬灭基团为bhq1。

3.一种含有权利要求1所述的检测穿山甲东阳病毒的taqman荧光定量pcr引物组的试剂盒。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括：荧光定量pcr预混液2×taqman universal probe mix、阳性对照和阴性对照；所述的阳性对照为含有穿山甲东阳病毒的5'utr基因的重组质粒，所述的阴性对照为ddh2o。

5.权利要求1所述的检测穿山甲东阳病毒的taqman荧光定量pcr引物组在制备用于检测穿山甲东阳病毒的试剂中的用途，所述的试剂用于检测来自于穿山甲的样本。

6.一种非疾病诊断目的的检测穿山甲东阳病毒的taqman荧光定量pcr方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的步骤s2的荧光定量pcr扩增的反应体系为20μl，包含：2×taq man universal probe mix 10μl、10μm的引物f1.0μl、10μm的引物r1.0μl、10μm的探针p 0.4μl、cdna模板1.0μl，加ddh2o补足至20μl；所述的荧光定量pcr扩增的反应程序为：预变性95℃2min，40个循环：变性95℃15s、退火60℃40s延伸，并在60℃收集荧光信号。

技术总结
本发明公开了一种检测穿山甲东阳病毒的TaqMan荧光定量PCR引物组、试剂盒及方法。本发明以穿山甲东阳病毒检测的5'UTR区域作为目标基因，根据TaqMan实时荧光PCR的基本原理，设计2条特异性引物和1条探针，建立一种简便、高效、实用的检测方法。本发明的穿山甲东阳病毒检测方法扩增曲线良好，特异性强，与除穿山甲东阳病毒之外的其他可感染穿山甲的病毒没有交叉反应；敏感性高，检测10倍梯度稀释的阳性标准品，最低检出限度为1.86×10<supgt;1</supgt;copies/μL；本发明方法具有灵敏度高、特异性强、耗时短等优势。

技术研发人员：张立娜,刘桂红,刘昊,窦红亮,胡婷婷
受保护的技术使用者：广东生态工程职业学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15