解木糖赖氨酸芽孢杆菌内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其应用

背景技术：

1、诺欣妥(entresto)是诺华公司研发的脑啡肽酶抑制剂沙库必曲(sacubitril)和血管紧张素ⅱ受体拮抗剂缬沙坦(valsartan)复方制剂(entresto)，用于射血分数降低的成人慢性心衰患者，以降低其心血管死亡和心衰住院的风险。该药物于2015年7月由fda批准上市，2017年7月经nmpa批准在中国上市。2021年nmpa批准了诺欣妥的新适应症，用于治疗原发性高血压。

2、d-4,4’-联苯丙氨酸是沙库必曲的关键手性中间体，可以通过4-溴-d-苯丙氨酸与苯硼酸偶联制备(ahmed st.acs catal，2015,5(9),5410–5413)。以4-溴-l-苯丙氨酸或4-溴-dl-苯丙氨酸为原料，通过l-氨基酸脱氨酶和d-氨基酸转氨酶的级联催化手性反转和去消旋化合成4-溴-d-苯丙氨酸，ee>99％，但该方法的缺点是需要化学计量的d-谷氨酸(walton cjw et al.chemcatchem,2018.10(2),470-474.)。以内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶(meso-diaminopimelate dehydrogenase,dapdh)为生物催化剂催化4-溴苯丙酮酸不对称还原胺化是合成4-溴-d-苯丙氨酸的最好方法。以共表达cgdapdhbc621-gdh的全细胞为生物催化剂，40mmol/l 4-溴苯丙酮酸转化为4-溴-d-苯丙氨酸，转化率>95％。4-溴-d-苯丙氨酸分离收率69％，ee>99％(parmeggiani f et al.adv synth catal,2016,358(20),3298-3306.)。该方法的缺点是dapdh的酶活低，热稳定性差，不能实现4-溴-d-苯丙氨酸的高浓度合成。

3、源于嗜热球型芽孢杆菌(ureibacillus thermosphaericus)的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶(utdapdh)，其突变体utdapdhd94a对苯丙酮酸的比活力相对于野生型提高了8倍，且具有很高的热稳定性(hayashi j et al.app environ microb,2017,83(11),e00491-17.)。

4、解木糖赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillus xylanilyticus)xx-2中的l-氨基酸脱氢酶已用于系列酮酸的制备(夏仕文等.zl201510697875.6,2016-02-10.)和l-2-氨基己二酸的生物合成(刘娇等.分子催化,2023,37(3),285-292.)。通过全基因组测序和基因注释发现该菌株中存在内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶基因(lxdapdh)。通过序列比对发现lxdapdh基因与utdapdh有很高的相似性(89％)，其突变体lxdapdhd94a对苯丙酮酸的活性相较于野生型提高了37倍。

技术实现思路

1、为解决内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶催化制备4-溴-d-苯丙氨酸过程中存在酶活低，转化强度低的技术问题，本发明提供了一种解木糖赖氨酸芽孢杆菌内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体lxdapdhd94a以及利用该突变体催化4-溴苯丙酮酸不对称还原胺化合成4-溴-d-苯丙氨酸的方法。

2、本发明的第一个目的是提供一种解木糖赖氨酸芽孢杆菌内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶(lxdapdh)突变体，所述突变体是将氨基酸序列如seq id no.1所示的野生型内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的第94位天冬氨酸突变为丙氨酸。突变体命名为lxdapdhd94a，其氨基酸序列如seq id no.2所示。

3、本发明的第二个目的是提供一种lxdapdhd94a和巨大芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶(bmgdh)共表达的重组菌株。lxdapdhd94a和bmgdh采用同源重组技术共表达在大肠杆菌bl21中。

4、本发明的第三个目的是利用lxdapdhd94a和bmgdh共表达的重组菌细胞，以4-溴苯丙酮酸为原料制备4-溴-d-苯丙氨酸。在催化反应体系中，共表达细胞的浓度为20-50g(湿重)/l，4-溴苯丙酮酸浓度为50-300mmol/l，氯化铵浓度为100-300mmol/l，碳酸钠浓度为50-200mmol/l，甲醇的体积百分比为2-10％，nadp+浓度为0.2-1.0mmol/l。反应温度20-50℃，ph8-11，反应时间10-50h。

5、优选地，共表达细胞的浓度为30g(湿重)/l，4-溴苯丙酮酸浓度为200mmol/l，氯化铵浓度为200mmol/l，碳酸钠浓度为100mmol/l，甲醇的体积百分比为4％，nadp+浓度为0.5mmol/l。反应温度30℃，ph9.0，反应时间24h。

6、4-溴-苯丙酮酸的转化率，4-溴-d-苯丙氨酸的产率、化学纯度和光学纯度采用高效液相色谱(hplc)检测。

7、非手性hplc。色谱柱：sepax mah-c18(250×4.6mm，5μm)；流动相：0.1％三氟乙酸水溶液/甲醇(49/51，v/v)；流速：1ml/min；检测波长：254nm；柱温：25℃。4-溴苯丙酮酸和4-溴-d-苯丙氨酸的保留时间分别为12.3min和4.2min。

8、手性hplc。色谱柱：crownpak cr(+)(150×4.0mm，5μm)，流动相：hclo4溶液(ph1.3)，流速：1.0ml/min，检测波长：200nm，柱温：30℃。4-溴苯丙氨酸的l-和d-对映体保留时间分别为12.3min和7.1min。

9、本发明的有益效果

10、本发明构建的lxdapdhd94a-bmgdh共表达菌株，稳定性好，耐热性强，催化活性高。建立的基于lxdapdhd94a-bmgdh的制备方法，适合4-溴-d-苯丙氨酸的工业化生产。

技术特征：

1.一种内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶来源于解木糖赖氨酸芽孢杆菌，野生酶的氨基酸序列和编码该酶的核苷酸序列如seq id no.1所示(genbank号为oq559328)。

2.一种内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体，其特征在于，seq id no.1中的氨基酸序列的第94位天冬氨酸突变为丙氨酸。

3.一种内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体，其特征在于，突变酶的氨基酸序列和编码该突变酶的核苷酸序列如seq id no.2所示。

4.一种内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体应用，其特征在于，突变酶lxdapdhd94a基因和巨大芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因(bmgdh，如seq id no.3所示)通过同源重组共表达在大肠杆菌bl21中。

5.如权利要求4所述的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体应用，其特征在于，共表达菌株于30-37℃下培养至od600为0.6-0.8，加入诱导剂iptg(终浓度为0.05-1mmol/l)于30-40℃诱导表达2-5h。

6.如权利要求4所述的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体应用，其特征在于，在制备4-溴-d-苯丙氨酸的催化反应体系中，共表达细胞的浓度为20-50g(湿重)/l，4-溴苯丙酮酸浓度为50-300mmol/l，氯化铵浓度为100-300mmol/l，碳酸钠100-300mmol/l，甲醇的体积百分比为2-10％，nadp+浓度为0.05-0.2mmol/l。反应温度20-50℃，反应时间10-50h。

技术总结
本发明公开了一种源于解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)的内消旋‑二氨基庚二酸脱氢酶(LxDAPDH)突变体及其应用，属于生物工程技术领域。该突变体是将解木糖赖氨酸芽孢杆菌内消旋‑二氨基庚二酸脱氢酶的第94位天冬氨酸氨酸突变为丙氨酸。以大肠杆菌BL21为宿主，突变体LxDAPDHD94A基因和源于巨大芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶(BmGDH)基因采用同源重组技术共表达。以共表达菌株的全细胞为生物催化剂，4‑溴苯丙酮酸和氯化铵为底物，葡萄糖为辅底物制备4‑溴‑D‑苯丙氨酸。4‑溴苯丙酮酸的转化率为95％。D‑4‑溴苯丙氨酸的分离收率为80％，ee>99％。

技术研发人员：夏仕文,黄文薪
受保护的技术使用者：重庆邮电大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/25