端粒扩增子测序用试剂盒及预文库构建方法与流程

本发明涉及基因测序，具体地涉及基于定点成环连接的端粒扩增子预文库的试剂盒及构建方法。

背景技术：

1、端粒是位于真核生物线性染色体末端，由端粒dna重复序列和相关蛋白质构成的复合物。由于线性染色体的dna复制机制，使得细胞的每次分裂导致端粒缩短。端粒的变化与多种疾病密切相关，如癌症、早衰综合征等。因此尽可能准确的对端粒进行检测可以提供与疾病相关的重要信息。

2、由于端粒序列较长，且其中含有大量6碱基简单重复序列，人端粒序列的重复单元为ttaggg(forward strand)/ccctaa(reverse strand)，总长度约2kb-20kb，使用二代测序(ngs，代表平台为illumina、mgi)无法测通，只能使用针对长片段测序方法(比如纳米孔测序技术)对长度在5kb以上的片段进行序列测定。

3、在上述测序中的常规建库方法依然存在无法区分完整端粒末端和基因组断裂端点的问题，由于基因组在提取过程中会造成大量断裂端点，此外还会存在一定量的不完整端粒末端，数量远远多于完整的端粒末端，常规的端粒建库方式无法有效地对其进行区分，将会导致这一类的建库方法无法对完整或长片段端粒序列进行有效富集，长片段端粒序列占比极低，短片段偏好严重，导致文库有效数据占比低下，会造成测序数据量的极大浪费，同时也极易导致纳米孔测序失败，很难测到准确的端粒序列和真实的长度分布状态，严重影响后续分析和解读。

4、此外，由于三代测序等长片段测序平台的芯片孔数限制，常规建库方法直接建库很难测到端粒序列，很难通过加大数据量来弥补，因此测序时多在带有接头的文库基础上，使用设计的端粒特异性引物和文库接头上的另一条引物进行pcr扩增，进行端粒序列的富集，但因为提取时产生的断点数量较多，还有大量的不完整端粒末端，造成富集效率较低，测到的端粒序列很少，无法有效进行端粒序列测定。另外，存在多个染色体末端序列未确定，也存在染色体的末端序列不能找到理想的引物序列，因此此方法也有局限，只能测定部分染色体的端粒序列，且其比例异常。

5、目前仍需要一种基于定点成环连接的端粒扩增子预文库的构建方法及试剂盒。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的至少部分技术问题，本发明人设计了基于定点成环连接的端粒特异性接头，该端粒特异性接头可识别完整端粒末端，并避免非完整末端被建库。同时，本发明利用端粒特异性的pcr外侧引物进行巢式扩增，获得完整端粒扩增子预文库。具体地，本发明包括以下内容。

2、本发明的第一方面，提供一种基于定点成环连接的端粒扩增子预文库构建试剂或试剂盒，其包含端粒特异性接头和端粒特异性pcr引物，所述端粒特异性接头包括引物结合区和含有封闭基团的端粒特异性结合区，所述端粒特异性结合区包含能够与端粒3’端悬臂的至少部分特异性结合的序列。

3、在某些实施方案中，根据本发明所述的基于定点成环连接的端粒扩增子预文库构建试剂或试剂盒，其中，所述端粒特异性pcr引物包括seq id no.1-12所示序列中的至少一种外侧引物和seq id no.13-24所示序列中的至少一种内侧引物序列。

4、在某些实施方案中，根据本发明所述的基于定点成环连接的端粒扩增子预文库构建试剂或试剂盒，其中，所述端粒特异性接头序列的5’端具有磷酸化修饰。

5、在某些实施方案中，根据本发明所述的基于定点成环连接的端粒扩增子预文库构建试剂或试剂盒，其中，所述封闭基团选自双脱氧核苷、氨基、间臂、磷酸化基团中的任意一种。

6、在某些实施方案中，根据本发明所述的基于定点成环连接的端粒扩增子预文库构建试剂或试剂盒，其中，所述端粒特异性接头进一步包含非标准dna或rna类似物，其选自/ixna_a/、/ixna_t/、/ixna_g/和/ixna_c/中的至少一种。

7、在某些实施方案中，根据本发明所述的基于定点成环连接的端粒扩增子预文库构建试剂或试剂盒，其中，所述端粒特异性结合区具有高于55℃的tm值。

8、在某些实施方案中，根据本发明所述的基于定点成环连接的端粒扩增子预文库构建试剂或试剂盒，其中，所述引物结合区对应的引物序列的tm值在55℃-70℃之间。

9、在某些实施方案中，根据本发明所述的基于定点成环连接的端粒扩增子预文库构建试剂或试剂盒，其中，所述端粒特异性结合区的长度为5-30nt。

10、本发明的第二方面，提供一种基于定点成环连接的端粒扩增子预文库的构建方法，其包括以下步骤：

11、(1) 使包含端粒3’悬臂的样本片段与本发明所述的试剂或试剂盒中的端粒特异性接头混合，在适于杂交的条件下进行杂交得到杂交体；

12、(2) 在环化酶的作用下，使所述杂交体中的端粒特异性接头末端与端粒3’悬臂末端连接成环；

13、(3) 使用本发明所述的试剂或试剂盒中的端粒特异性接头引物和端粒特异性pcr引物对步骤(2)得到产物进行扩增，得到所述基于定点成环连接的端粒扩增子预文库。

14、在某些实施方案中，根据本发明所述的基于定点成环连接的端粒扩增子预文库的构建方法，其中，步骤(3)中的扩增包括：

15、a. 使用本发明所述的试剂或试剂盒中的端粒特异性pcr引物的外侧引物和用于扩增端粒特异性接头的外侧引物进行第一扩增；和

16、b. 使用本发明所述的试剂或试剂盒中的端粒特异性pcr引物的内侧引物和用于扩增端粒特异性接头的内侧引物进行第二扩增。

17、本发明设计的基于定点成环连接的端粒特异性接头、预文库及其制备方法高效地富集了完整端粒末端序列，从而有效地对其进行序列测定，更真实准确地展示各染色体端粒长度的分布状态，实现更准确的关联分析和解读。此外，本发明在端粒序列附近的基因组序列上还设计了针对端粒扩增使用的端粒特异性pcr引物，在连接接头后不需要进行酶切处理，同时也不需要再在片段两端添加通用接头，进一步简化了实验流程。

技术特征：

1.一种基于定点成环连接的端粒扩增子预文库构建试剂或试剂盒，其特征在于，包含端粒特异性接头和端粒特异性pcr引物，所述端粒特异性接头包括引物结合区和含有封闭基团的端粒特异性结合区，所述端粒特异性结合区包含能够与端粒3’端悬臂的至少部分特异性结合的序列。

2. 根据权利要求1所述的基于定点成环连接的端粒扩增子预文库构建试剂或试剂盒，其特征在于，所述端粒特异性pcr引物包括seq id no.1-12所示序列中的至少一种外侧引物和seq id no.13-24所示序列中的至少一种内侧引物序列。

3.根据权利要求2所述的基于定点成环连接的端粒扩增子预文库构建试剂或试剂盒，其特征在于，所述端粒特异性接头序列的5’端具有磷酸化修饰。

4.根据权利要求1所述的基于定点成环连接的端粒扩增子预文库构建试剂或试剂盒，其特征在于，所述封闭基团选自双脱氧核苷、氨基、间臂、磷酸化基团中的任意一种。

5.根据权利要求1所述的基于定点成环连接的端粒扩增子预文库构建试剂或试剂盒，其特征在于，所述端粒特异性接头进一步包含非标准dna或rna类似物，其选自/ixna_a/、/ixna_t/、/ixna_g/和/ixna_c/中的至少一种。

6.根据权利要求1所述的基于定点成环连接的端粒扩增子预文库构建试剂或试剂盒，其特征在于，所述端粒特异性结合区具有高于55℃的tm值。

7.根据权利要求6所述的基于定点成环连接的端粒扩增子预文库构建试剂或试剂盒，其特征在于，所述引物结合区对应的引物序列的tm值在55℃-70℃之间。

8.根据权利要求7所述的基于定点成环连接的端粒扩增子预文库构建试剂或试剂盒，其特征在于，所述端粒特异性结合区的长度为5-30nt。

9.一种基于定点成环连接的端粒扩增子预文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

10. 根据权利要求9所述的基于定点成环连接的端粒扩增子预文库的构建方法，其特征在于，步骤(3)中的扩增包括：

技术总结
本发明公开端粒扩增子测序用试剂盒及预文库构建方法。本发明设计了一种端粒特异性接头，其包括引物结合区和含有封闭基团的端粒特异性结合区，该端粒特异性结合区能够与端粒3’端悬臂的至少部分特异性结合。本发明的端粒特异性接头可识别完整端粒末端，并避免非完整末端被建库。此外，本发明在端粒序列附近的基因组序列上还设计了针对端粒扩增使用的端粒特异性PCR引物，在连接接头后不需要进行酶切处理，同时也不需要再在片段两端添加通用接头，进一步简化了实验流程。

技术研发人员：纪鑫,倪守峰,王伟伟,田埂
受保护的技术使用者：元码基因科技（北京）股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15