一种野生芽孢杆菌催化芳香醛合成芳香醇的方法及其应用

本发明涉及生物工程，具体而言，涉及一种野生芽孢杆菌bacillussp.cczu11-1，cgmcc no.9297催化芳香醛合成芳香醇的方法及其应用。

背景技术：

1、生物质作为一种可再生资源，在生物精炼技术改进方面具有巨大的潜力。大多数生物质都是作为燃烧材料，会导致空气的污染和全球变暖。生物质中的木质素解聚的主要常见单体化合物为丁香醛、香草醛、对羟基苯甲醛等芳香醛。多项研究发现，芳香醛经过还原反应得到的芳香醇具有很大的价值。

2、例如，对羟基苯甲醇是加利车霉素缀合物中的合成试剂，用于治疗急性髓细胞性白血病。香草醇可用作食品添加剂、镇静剂，此外还有促进胆汁分泌、抗惊厥的作用。水杨醇是合成抗炎和防治肝炎等药物的重要中间体。其衍生物乙酰水杨酸,是阿斯匹林的活性化学成分。茴香醇可用作为食品添加剂。枯茗醇具有优雅的花香和轻微的皮革气味,可用于调制多种香型的香精,并可用作柠檬香韵改良。苯甲醇由于沸点高，不易挥发，疏水性强等特点，可用作环氧树脂稀释剂。

3、目前，芳香醇通常通过化学合成来实现。然而化学合成工艺通常反应条件苛刻，处理工艺复杂，违反绿色化学的原理，化学法合成芳香醇的过程中用到高温高压，强酸或强碱以及金属催化剂，会对环差生污染。例如，传统的合成对羟基苯甲醇利用惰性气体和氢气在高温下进行(cn202010282714.1)；yang等人以双活性位点ni-niin作为催化剂加氢气催化糠醛合成糠醇，这种方法制备的催化剂需要高温高压的条件(k.yang,y.li.fuel，2022)。

4、生物催化法高效环保，反应条件温和，基本没有副产物的生产。与酶催化相比，全细胞催化，细胞内具有完整的多酶体系，无需酶纯化即可实现酶的级联反应，操作简便，生产成本更低。目前研究使用含羰基还原酶的重组菌株能够将300mm的糠醛(he et al.greenchemistry,2023)和250mm的5-羟基甲糠醛(xia et al.enzyme and microbialtechnology，2020)以较高的产率还原为对应的醇类产物。但重组菌普遍存在对底物浓度的耐受度不高的问题，从而限制了其在工业上的应用和发展。因而有必要改变所使用的全细胞催化剂的类型，开发一种能够还原高浓度的芳香醛合成芳香醇的全细胞生物催化工艺，这是很有意义和潜力的。

技术实现思路

1、本发明目的是提供一种野生芽孢杆菌生物催化芳香醛合成芳香醇的方法及该芳香醇的应用。高效绿色的生物还原工艺，有利于芳香性产品的高附加值应用，实现对生物质资源的充分利用。

2、本发明提供的一种野生芽孢杆催化芳香醛还原合成芳香醇的方法，具体的，该野生芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌bacillus sp.cczu11-1，其保藏号为cgmcc no.9297，该菌株已在中国专利公开号105018368a中公开。

3、本发明的芳香醛指来源于芳香性及其衍生的醛类化合物，包括丁香醛、水杨醛、茴香醛、枯茗醛、对羟基苯甲醛、苯甲醛、对氯苯甲醛、5-氯水杨醛、香兰素甲醚、乙基香兰素、邻香草醛、2-羟基-4-甲氧基苯甲醛、4-硝基苯甲醛、2-羟基-5-甲氧基苯甲醛、2-羟基-6-甲氧基苯甲醛、异香兰素、香草醛、糠醛、5-羟甲基糠醛、苯乙醛、苯丙醛中的任意一种。

4、本发明提供的生物催化合成芳香醇的方法，具体所述应用的方法为：在缓冲溶液中加入芳香醛，助溶剂，共底物和芽孢杆菌全细胞，在25～45℃、ph6～8、180rpm条件下，进行反应，反应时间为0.5～24h，待反应结束，反应液使用乙酸乙酯萃取，分层，取出有机相旋蒸，获得芳香醇。

5、其中，所述反应体系中，芽孢杆菌全细胞的制备方法为，将芽孢杆菌bacillussp.cczu11-1。cgmcc no.9297在摇瓶培养基中进行扩增培养120～150h，培养温度为25～45℃，液体培养基组分和含量如下：蛋白胨20～80g/l，酵母膏20～40g/l，kh2po4 4～12g/l，nacl 0.4～8g/l，mgso40.4～8g/l。将含菌的培养基在离心机上以8000rpm的速度离心5分钟，去除上清液，即得到了湿菌体。

6、其中，所述反应体系中，底物芳香醛的浓度为50～1500mm，优选500～1200mm。

7、其中，所述反应体系中，芽孢杆菌全细胞催化剂用量为5～100g/l，优选为50g/l。

8、其中，所述反应体系中，共底物与芳香醛的摩尔比为0.25～3:1,；优选1.5～3；1；共底物为葡萄糖、异丙醇、甲酸、乙醇中的一种，优选为葡萄糖。

9、其中，所述反应体系中，助溶剂的体积浓度为1～8％，优选2～5％；助溶剂为二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺的一种，优选助溶剂为二甲基亚砜。

10、其中，所述反应体系中，缓冲溶液为浓度为100mm的磷酸盐缓冲液，ph为6～8，优选的ph为6.5～7.5；更优选ph为6.5。

11、进一步地，所述反应体系中还可以包括辅酶，辅酶与芳香醛的摩尔比为0.01～3:1；优选1～3:1；辅酶为nad+、nadp+中的一种，优选为nad+。

12、进一步地，本发明的芽孢杆菌催化芳香醛与呋喃醛类化合物和还原后的芳香醇结构如下：

13、

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15、本发明的野生芽孢杆菌催化芳香醛合成芳香醇的方法，其芳香醇类化合物的产率均在85％以上。所制备的糠醇、对羟基苯甲醇具有抗氧化活性，可用于抗氧化。可以加入到医药工业(防止药品的氧化降解，保证药品的质量和疗效)、橡胶工业(防止橡胶制品的老化和劣化，延长橡胶制品的使用寿命)、金属加工工业(防止金属的氧化腐蚀，保护金属的表面光洁度和使用寿命)，能有效抑制其在运输、储藏、销售过程中的氧化降解，保证质量和稳定性。

16、本发明的有益效果：

17、本发明首次提供一种野生芽孢杆菌催化芳香醛类合成芳香醇的方法，在高浓度的醛类化合物的还原转化过程中都具有较高的选择性与转化率。采用全细胞催化合成工艺，操作简便，反应条件温和，生产成本低。

技术特征：

1.一种芽孢杆菌催化芳香醛合成芳香醇的方法，其特征在于，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌bacillus sp.cczu11-1，保藏号为cgmcc no.9297。

2.根据权利要求1所述的芽孢杆菌催化芳香醛合成芳香醇的方法，其特征在于，具体的方法为：在缓冲溶液中加入底物芳香醛，助溶剂，共底物，芽孢杆菌全细胞，在25～45℃、ph6～8、180rpm的摇瓶中进行反应，反应时间为0.5～24h，待反应结束，反应液使用乙酸乙酯萃取有机相，旋蒸获得芳香醇。

3.根据权利要求2所述的芽孢杆菌催化芳香醛合成芳香醇的方法，其特征在于，所述芽孢杆菌全细胞的制备方法为：将枯草芽孢杆菌bacillus sp.cczu11-1在摇瓶培养基中进行扩增培养培养温度为25～45℃，培养时间为120～150h，将含菌的培养基以8000rpm的速度离心5分钟，去除上清液，即得到了芽孢杆菌全细胞；所述培养基组分和含量如下：蛋白胨20～80g/l，酵母膏20～40g/l，kh2po44～12g/l，nacl 0.4～8g/l，mgso40.4～8g/l。

4.根据权利要求2所述的芽孢杆菌催化芳香醛合成芳香醇的方法，其特征在于，反应体系中芳香醛的浓度为50～1500mmol/l；芽孢杆菌全细胞的浓度为5～100g/l。

5.根据权利要求2所述的芽孢杆菌催化芳香醛合成芳香醇的方法，其特征在于，所述共底物与芳香醛的摩尔比为0.25～3:1，所述共底物选自葡萄糖，异丙醇，甲酸，乙醇中的一种。

6.根据权利要求2所述的芽孢杆菌催化芳香醛合成芳香醇的方法，其特征在于，所述助溶剂体积浓度为1～8％；所述助溶剂选自二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺的一种。

7.根据权利要2所述的芽孢杆菌催化芳香醛合成芳香醇的方法，其特征在于，缓冲溶液为100mmol/l的磷酸盐缓冲液，ph为6～8。

8.根据权利要求2所述的芽孢杆菌催化芳香醛合成芳香醇的方法，其特征在于，反应体系中还包括辅酶，所述辅酶与芳香醛的摩尔比为0.5～3:1；所述辅酶选自nadp+或nad+中的一种。

9.根据权利要求2所述的芽孢杆菌催化芳香醛合成芳香醇的方法，其特征在于，所述芳香醛为丁香醛、水杨醛、茴香醛、枯茗醛、对羟基苯甲醛、苯甲醛、对氯苯甲醛、5-氯水杨醛、香兰素甲醚、乙基香兰素、邻香草醛、2-羟基-4-甲氧基苯甲醛、4-硝基苯甲醛、2-羟基-5-甲氧基苯甲醛、2-羟基-6-甲氧基苯甲醛、异香兰素、香草醛、糠醛、5-羟甲基糠醛、苯乙醛、苯丙醛中的任意一种。

10.一种如权利要求1-9任一项所述方法制备的芳香醇的应用，其特征在于，所述芳香醇在天然香薰精油抗氧化中的应用。

技术总结
本发明提供了一种野生芽孢杆菌催化芳香醛合成芳香醇的方法及其应用，属于生物工程技术领域，所述还原的野生芽孢杆菌是芽孢杆菌Bacillus sp.CCZU11‑1，其保藏编号为CGMCC No.9297。该菌能够有效还原高底物浓度的芳香醛，分别得到对应的芳香醇。该方法工艺简洁、经济环保，且进一步减少了副产物生成，提高了生产效率和收率。

技术研发人员：何玉财,孔令辉,陈鹏,张朝伟,杨丹,李祥国,唐卫,胡蝶,魏亚男,樊博
受保护的技术使用者：常州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/5