一种重组杆状病毒AcMNPV-me53-egfp及其构建和应用

本发明涉及重组病毒，具体属于一种重组杆状病毒acmnpv-me53-egfp及其构建方法，该重组病毒具备强的增殖能力，可用于制备防治草地贪夜蛾的微生物杀虫剂的特征。

背景技术：

0、技术背景

1、杆状病毒杀虫剂作为农作物、森林害虫防治的新型安全的生物农药，现如今已经越来越受到人们的重视。在生态系统中，杆状病毒常常在抑制许多不同类型的昆虫中发挥着非常重要作用。杆状病毒作为杀虫剂的优点有：杆状病毒作为昆虫的病原体，不会对植物以及无脊椎动物产生危害；环境方面比较友好；特异性强；致病性强；基因操作简单；最小残留；无毒无害。因此，早在1973年，就被联合国粮农组织推荐作为化学农药的理想替代品。

2、尽管该应用引起人们广泛的兴趣且具有内在的吸引力，但是人们对病毒用于昆虫控制的接受程度还是有限的。杆状病毒作为杀虫剂的缺点有：它们杀灭昆虫的速度比较慢；它们的宿主范围受限(一种制剂只能用于极少数昆虫)。这在一定程度上受制于生产标准化病毒制剂的复杂程度。所以，提高杆状病毒在宿主害虫的增殖速度从而提高其抗虫活性已成为当今研发杆状病毒生物杀虫剂的发展方向。

3、由于杆状病毒基因组较大，不能直接对其进行操作插入外源基因，因此需要通过中间载体获得重组杆状病毒。me53的同源基因存在于所有鳞翅目昆虫的核型多角体病毒(npv)和颗粒体病毒(gv)基因组中，在感染后期me53位于细胞边缘并且与gp64和vp39衣壳共定位，me53与出芽型病毒(bv)的核衣壳相关，推测它连接了核衣壳和病毒囊膜。因此，本发明通过基因工程方法，将me53-egfp基因整合入苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(acmnpv)，构建了重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体杆状病毒acmnpv-me53-egfp，实验证明，该重组病毒可显著提高在昆虫宿主细胞中的增殖率，并减少对草地贪夜蛾幼虫的半致死时间，因此，可单独或联合其它抗虫或外源基因构建高效的重组杆状病毒杀虫剂。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种重组杆状病毒，该重组杆状病毒可以通过在感染草地贪夜蛾sf9细胞后提升病毒的增殖率。

2、本发明的目的还在于提供一种该重组杆状病毒的构建方法，包括获得重组杆状病毒的中间载体的构建方法。

3、为实现本发明的上述目的，可以通过如下技术方案实现：

4、本发明提供的一种重组杆状病毒acmnpv-me53-egfp，该重组病毒为将序列为seqidno.1所示的基因通过bac-to-bac转座重组系统整合到acmnpv基因组中获得。该基因序列为苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒acmnpv的me53基因和水母增强型绿色荧光蛋白egfp基因的串联基因。

5、该重组杆状病毒可以在sf9宿主细胞中表达融合蛋白me53-egfp。

6、本发明提供的一种重组杆状病毒acmnpv-me53-egfp的构建方法，包括如下步骤：

7、(1)以acmnpv基因组为模板，通过pcr技术，以me53-f(seq id no.2)和me53-r(seqid no.3)为引物，扩增获得me53基因片段；接着，通过限制性内切酶酶切和连接反应将该基因构建到质粒pfastbacdual-egfp上，获得重组质粒pfastbacdual-me53-egfp，该重组质粒含有seq id no.1基因；

8、(2)将重组质粒pfastbacdual-me53-egfp转化dh10b感受态细胞，目的基因ac-me53-egfp通过tn7转座重组转座到dh10b感受态细胞中的bacmid上，之后将转化的dh10b细胞涂lb平板；

9、(3)通过pcr方法筛选包含重组成功的bacmid-me53-egfp的dh10b单菌落，提取重组杆粒bacmid-me53-egfp；

10、(4)将重组杆粒bacmid-me53-egfp和mirusbiomir 6104–insecttransfection reagent转染试剂混匀，转染sf9细胞，获得重组杆状病毒acmnpv-me53-egfp。

11、本发明的重组杆状病毒acmnpv-me53-egfp具备强的增殖能力，可用于制备防治草地贪夜蛾的微生物杀虫剂。

12、本发明的重组杆状病毒acmnpv-me53-egfp感染sf9细胞后，第一、二、三代病毒在细胞中表达绿色荧光蛋白逐渐增多；tcid50实验结果显示，acmnpv-me53-egfp相较于acmnpv-egfp，在sf9细胞中的增殖率显著提高；以4龄末期草地贪夜蛾幼虫为受试昆虫，病毒感染浓度为2.8×108vp/μl和2.8×109vp/μl时，acmnpv-me53-egfp相较于acmnpv-egfp处理组的半致死时间lt50分别提前0.707天和0.509天。

13、与现有技术相比，本发明的有益效果：

14、1、本发明的重组杆状病毒acmnpv-me53-egfp相较于野生型病毒能促进子代病毒增殖；

15、2、本发明的重组杆状病毒acmnpv-me53-egfp相较于野生型病毒能提高对草地贪夜蛾幼虫的杀虫效率。

技术特征：

1.一种me53-egfp基因，其核苷酸序列为seq id no.1。

2.一种重组杆状病毒acmnpv-me53-egfp，其特征在于，通过转座重组bac-to-bac系统将权利要求1所述的me53-egfp基因整合到苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒acmnpv基因组中获得。

3.如权利要求2所述的重组杆状病毒acmnpv-me53-egfp的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

4.如权利要求2所述的重组杆状病毒acmnpv-me53-egfp用于制备防治草地贪夜蛾的微生物杀虫剂。

技术总结
本发明提供了一种重组杆状病毒AcMNPV‑me53‑egfp及其构建和应用，所述重组杆状病毒为将me53‑egfp基因通过转座重组整合到杆状病毒—苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒AcMNPV(Autographa californica nucleopolyhedrovirus)的基因组上获得的。本发明还提供了重组杆状病毒的构建方法，包括从AcMNPV基因组获得me53基因，将me53重组到pFastBacDual‑egfp，通过Bac‑to‑Bac系统获得重组杆状病毒AcMNPV‑me53‑egfp。通过实验证实AcMNPV‑me53‑egfp病毒较AcMNPV‑egfp相比，在宿主细胞中的增殖能力显著提高，并可减少对草地贪夜蛾幼虫的半致死时间。本发明的重组杆状病毒在制备防治草地贪夜蛾幼虫的生物杀虫剂方面具有应用前景。

技术研发人员：付月君,侯铄雨,王琛,宋莉,袁悉梅
受保护的技术使用者：山西大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/21