一种巢式位点特异性单引物PCR方法及其应用

本发明涉及基因工程，具体涉及一种巢式位点特异性单引物pcr方法及其应用。

背景技术：

1、基因组步移是指根据已知dna检索未知基因组区域的技术，在分子生物学和相关领域中占据了关键的地位。基因组步移广泛应用于识别转座因子的整合位点、全长功能基因、基因的调控区域等领域。

2、按照涉及的原理划分，现有的基于pcr的基因组步移方法通常可以分为三类：(1)反向pcr；(2)连接依赖的pcr，如盒式pcr、锅柄pcr和载体pcr；以及(3)随机引发pcr，如热不对称pcr、腕表pcr和自成型接头pcr等。反向pcr和连接依赖的pcr在扩增反应前，需要对基因组模板进行切割和连接操作，因而实验过程复杂，费时费力。而随机引发pcr不需要对基因组模板进行任何处理，实验成本低、工作量小，因此更受研究人员的青睐。

3、随机引发策略在第一轮巢式pcr中至少进行一个低温退火循环。这种低退火温度循环的作用是刺激步移引物随机退火到未知侧翼，形成一系列单链dna。其中目标单链产物(ssdna)因3’端存在特异性引物的结合位点，在接下来的一个高温循环中被转变为被两条引物包围的双链产物(dsdna)，该双链在剩余的高温循环中可以得到指数扩增；而非目标单链dna中缺乏任何引物的完美互补位点，导致无法继续进行扩增。再对第一轮pcr产物进行第二轮巢式pcr，甚至是第三轮pcr，这种单链dna成为主要产物。

4、现有的随机引发pcr需要使用步移引物，用于实现所谓的基因组步移。由于同时使用了位点特异性引物和随机步移引物，随机引发pcr方法在第一轮pcr中通常会形成三类非特异性产物：(一类)由特异性引物单独产生；(二类)由随机引物和特异性引物共同产生；(三类)由随机引物单独产生。其中前两类非特异性产物能通过下一轮的特异性引物轻松除去；如何消除第三类非特异性产物，是所有随机引发pcr面临的共同挑战；同时，现有的方法的退火程序较为复杂。

5、因此，有必要开发一种新的方案，以改善现有随机引发pcr中存在的问题——即如何消除第三类非特异性产物，从而增强步移的特异性；同时，降低所需要的引物数量，并简化退火程序。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种巢式位点特异性单引物pcr方法及其应用，以改善现有随机引发pcr中存在的问题——即如何消除第三类非特异性产物，从而增强步移的特异性。在本方法中，由于每轮pcr只使用了一条引物，因此(1)仅可能产生一种由特异性引物合成的第一类非特异性产物；(2)使用的引物数量较低，节约了成本。

2、本发明提供的一种巢式位点特异性单引物pcr方法，包括三轮巢式pcr反应，依次由一条巢式位点特异性单引物驱动，包括以下步骤：

3、从已知基因组dna序列上鉴定出3个嵌套式基因特异性引物，包括引物a、引物b、引物c；

4、由所述引物a进行第一轮pcr反应，得到第一轮pcr产物；

5、第一轮pcr反应结束后，由所述引物b进行第二轮pcr反应，得到第二轮pcr产物；

6、所述第二轮pcr反应结束后，由所述引物c进行第三轮pcr反应，所述第三轮反应结束得到具有特异性的第三轮pcr产物。

7、可选地，所述引物a、引物b、引物c在pcr反应体系中的浓度均为0.4μmol/l。

8、可选地，所述三个嵌套式基因特异性引物长度为23-28bp；所述引物退火温度为58-63℃。

9、可选地，由引物a进行第一轮pcr反应，所述第一轮pcr反应中包括三个退火阶段：5个60℃循环；1个25℃循环；30个60℃循环。

10、可选地，由引物b进行第二轮pcr反应，所述第二轮pcr反应包括一个退火阶段：30个60℃循环。

11、可选地，由引物c进行第三轮pcr反应，所述第三轮pcr反应包括一个退火阶段：30个60℃循环。

12、可选地，本发明提供的一种巢式位点特异性单引物pcr方法应用于探索dna侧翼未知序列。

13、可选地，本发明提供的一种巢式位点特异性单引物pcr方法可应用于填补基因组测序的缺口。

14、本发明的有益效果包括：

15、(1)与传统的随机引发pcr中使用的引物相比，本发明提供的一种巢式位点特异性单引物pcr方法中使用的特异性引物，不会在反应中产生第二类和第三类非特异性产物；

16、(2)本发明提供的一种巢式位点特异性单引物pcr方法与常规的巢式pcr相比，不需要使用随机步移引物，所使用的引物数量大幅减少；

17、(3)本发明提供的一种巢式位点特异性单引物pcr方法的反应热循环程序简单，第二轮和第三轮扩增反应全部为高温循环，有效降低了引物在目标片段内部发生退火的可能，从而能减少短片段的产生，改善常规随机引发pcr的多条带现象；

18、(4)本发明提供的一种巢式位点特异性单引物pcr方法应可应用于探索dna侧翼未知序列以及填补基因组测序的缺口。

技术特征：

1.一种巢式位点特异性单引物pcr方法，其特征在于，所述方法包括三轮巢式pcr反应，依次由一条巢式位点特异性单引物驱动，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引物a、引物b、引物c在pcr反应体系中的浓度均为0.4μmol/l。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述三个嵌套式基因特异性引物长度为23-28bp；所述引物退火温度为58-63℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，每一轮pcr仅产生由该轮引物包围的非特异性产物，所述非特异性产物会被下一轮pcr反应消除。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，由引物a进行第一轮pcr反应，所述第一轮pcr反应中包括三个退火阶段：5个60℃循环；1个25℃循环；30个60℃循环。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，由引物b进行第二轮pcr反应，所述第二轮pcr反应包括一个退火阶段：30个60℃循环。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，由引物c进行第三轮pcr反应，所述第三轮pcr反应包括一个退火阶段：30个60℃循环。

8.如权利要求1所述的方法在探索dna侧翼未知序列中的应用。

9.如权利要求1所述的方法在填补基因组测序的缺口中的应用。

技术总结
本发明提供了一种巢式位点特异性单引物PCR方法及其应用。本发明提供的方法从每个遗传位点上鉴定出3个引物，引物A、B、C，首先，在60℃条件下引物A在基因组的特定位置合成ssDNA，随后的25℃，使得引物A有机会退火至刚刚合成的靶ssDNA上未知区域的某些位点，这样便成功实现了引物A的步移。随后的第二轮和第三轮PCR中，引物B和引物C完成相同的步移，此方法成功建立；而非目标产物在第二轮和第三轮反应过程中被抑制。本发明提供的方法能够通过一段已知序列即可探索其侧翼的未知序列，同时本发明能够应用于基因测序中缺口的填补。

技术研发人员：李海星,郭新月,潘豪,潘振康,陈红,王蓉蓉,田冰坤
受保护的技术使用者：南昌大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/21