重组红色红球菌及其在化合物合成中的应用

本申请涉及基因工程和合成生物，具体涉及一种重组红色红球菌及其在化合物合成中的应用。

背景技术：

1、红色红球菌是一种革兰氏阳性菌，在生物催化、生物降解和生物质利用等方面有重要的应用。目前含腈水合酶、腈水解酶、酰胺酶、转氨酶、环氧化物水解酶等重要工业酶的红球菌作为生物催化剂，已被广泛应用于酰胺、羧酸、手性医药中间体等重要化合物的工业化生产中。然而，在制备高浓度目标化学品时，底物或产物浓度过高、反应放热等问题容易导致红球菌细胞破裂，释放色素，导致产物溶液颜色加深，影响产品质量，增加产品后处理成本。因此，降低红球菌细胞内的色素含量，对于提高红球菌细胞催化产物的产品质量、降低生产成本有重要意义。

2、类胡萝卜素是一类由类异戊二烯聚合物构成的天然色素，广泛存在于动物、植物、真菌、藻类和细菌中，较为常见的是c40骨架的番茄红素、β-胡萝卜素、玉米黄质、虾青素、辣椒红素等四萜类化合物。多数红球菌可合成较大量的天然类胡萝卜素，故菌落颜色呈现橙黄色或红色。红球菌在生物催化反应中释放的色素主要为类胡萝卜素，但迄今为止，尚未有通过基因工程改造弱化红球菌色素合成的相关报道。

3、虽然类胡萝卜素生物合成的主要途径已基本明确，但大多数红球菌中类胡萝卜素合成的关键基因尚不清晰，特别是红色红球菌的类胡萝卜素合成相关途径迄今未见报道。红球菌通常含有冗余基因序列，有时存在多个不同基因编码相同功能的蛋白，但其活性通常存在较大差异，且难以预测具体哪个基因起主要催化作用，这也进一步增加了关键基因鉴定的难度。

技术实现思路

1、基于此，本申请有必要提供一种降低色素合成的重组红色红球菌，及其在酰胺类、羧酸类等化合物合成中的应用。

2、具体技术方案如下：

3、一种重组红色红球菌，所述重组红色红球菌中的类胡萝卜素合成基因被降低表达或者敲除；降低表达或者敲除的所述类胡萝卜素合成基因包括编码ggpp合成酶的基因 crte-1、编码八氢番茄红素脱氢酶的基因 crti、编码胡萝卜素合成相关膜蛋白的基因 crtm和编码八氢番茄红素合成酶的基因 crtb的至少一个。

4、在其中一个实施例中，降低表达或者敲除的所述类胡萝卜素合成基因包括编码ggpp合成酶的基因 crte-1和/或编码八氢番茄红素脱氢酶的基因 crti。

5、所述的重组红色红球菌在化合物合成中的应用。

6、在其中一个实施例中，所述化合物包括酰胺类化合物、羧酸类化合物、手性环氧化物和手性胺类化合物中的一种或多种。

7、相对于传统技术，本申请具备如下有益效果：

8、本申请分析和鉴定了与红色红球菌的类胡萝卜素合成的关键基因，通过使类胡萝卜素合成的关键基因失活，构建了不同的类胡萝卜素合成弱化的重组红色红球菌，筛选得到不影响红球菌的生长和产酶、同时降低色素含量的重组红色红球菌。进一步将其用于酰胺类、羧酸类、手性环氧化物和手性胺类等化合物合成，提高化合物的质量。

技术特征：

1.一种重组红色红球菌，其特征在于，所述重组红色红球菌中的类胡萝卜素合成基因被降低表达或者敲除；降低表达或者敲除的所述类胡萝卜素合成基因包括编码ggpp合成酶的基因crte-1、编码八氢番茄红素脱氢酶的基因crti、编码胡萝卜素合成相关膜蛋白的基因crtm和编码八氢番茄红素合成酶的基因crtb的至少一个。

2.根据权利要求1所述重组红色红球菌，其特征在于，降低表达或者敲除的所述类胡萝卜素合成基因包括编码ggpp合成酶的基因crte-1和/或编码八氢番茄红素脱氢酶的基因crti。

3.根据权利要求1或2所述重组红色红球菌，其特征在于，敲除包括敲除类胡萝卜素合成基因的部分或全部。

4.根据权利要求3所述重组红色红球菌，其特征在于，所述编码ggpp合成酶的基因crte-1的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述编码八氢番茄红素脱氢酶的基因crti的核苷酸序列如seq id no:3所示，所述编码胡萝卜素合成相关膜蛋白的基因crtm的核苷酸序列如seq id no:4所示，所述编码八氢番茄红素合成酶的基因crtb的核苷酸序列如seq idno:5所示。

5.根据权利要求3所述重组红色红球菌，其特征在于，敲除类胡萝卜素合成基因的方法包括同源重组双交换方法。

6.根据权利要求5所述重组红色红球菌，其特征在于，利用所述同源重组双交换方法构建重组红色红球菌的方法包括如下步骤：

7.根据权利要求1或2所述重组红色红球菌，其特征在于，降低类胡萝卜素合成基因表达的方法包括crispri技术、反义rna技术、rna干扰技术以及启动子弱化方法中的一种或多种。

8.根据权利要求7所述重组红色红球菌，其特征在于，利用所述crispri技术构建重组红色红球菌的方法包括将含有dcas9基因的载体和含有靶向类胡萝卜素合成基因的sgrna的载体导入到红球菌中，构建重组红色红球菌。

9.权利要求1~8任一项所述的重组红色红球菌在化合物合成中的应用，所述化合物包括酰胺类化合物、羧酸类化合物、手性环氧化物和手性胺类化合物中的一种或多种。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述酰胺类化合物包括丙烯酰胺和/或烟酰胺。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，丙烯酰胺或烟酰胺合成的方法包括如下步骤：利用所述重组红色红球菌的基因组表达腈水合酶，和/或通过在所述重组红色红球菌中引入携带有腈水合酶编码基因的外源质粒表达腈水合酶；

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述水合反应的温度为15℃~45℃。

技术总结
本申请涉及重组红色红球菌及其在化合物合成中的应用，该重组红色红球菌中的类胡萝卜素合成基因被降低表达或敲除；降低表达或敲除的所述类胡萝卜素合成基因包括编码GGPP合成酶的基因crtE‑1、编码八氢番茄红素脱氢酶的基因crtI、编码胡萝卜素合成相关膜蛋白的基因crtM和编码八氢番茄红素合成酶的基因crtB的至少一个。该重组红色红球菌不影响红球菌的生长和产酶、同时降低色素含量。

技术研发人员：于慧敏,梁有向,郑煜堃,陈博,王苗苗,李楠楠,赵明
受保护的技术使用者：清华大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15