贝莱斯芽孢杆菌的特异性引物、Taqman探针及实时荧光定量PCR检测方法

本发明提供了一种贝莱斯芽孢杆菌的特异性引物、taqman探针及实时荧光定量pcr检测方法，属于微生物pcr检测。

背景技术：

1、贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)是芽孢杆菌属的一个新种，属好氧细菌，陆续从水、土壤、动物肠道、发酵食品等处分离得到该菌种。贝莱斯芽孢杆菌菌落不透明，常为形成较大的灰白色或淡黄色菌落，菌落表面不规则、粗糙、中间凹陷、呈褶皱状。研究发现贝莱斯芽孢杆菌具有多酶活性和抗菌特性，是一种新型有益菌，尤其在促进生长和防治病原菌病害方面具有重要作用，能够产生多种生物活性物质促进饲料的高效转化、抑制致病菌的生长。更为重要的是，贝莱斯芽孢杆菌生物安全性高、抗逆性强，具有耐高温、耐盐的特性，已经作为作为畜禽或水产用益生菌产品逐步推广，对促进养殖业绿色健康的发展具有正向作用。

2、益生菌菌能否在养殖生物肠道内定植是应用过程中的核心问题，如何确定益生菌是否定植是实际生产过程中一个难点问题。传统的检测方法主要通过细菌分离培养和鉴定，此方法耗时长，操作繁琐，更重要的是由于肠道环境复杂，细菌种类繁多，容易出现误判。因此，开发出快速、准确、特异性和灵敏度高的检测方法，应用于贝莱斯芽孢杆菌定植和益生效果评价，对相应产品的推广和应用具有非常重要的作用。

3、taqman实时荧光定量是在pcr扩增中加入特异性的荧光探针，探针两端分别标记一个报告基团和一个淬灭基团。当探针完整地结合在dna单链上，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，检测不到荧光信号。qpcr扩增时，taqdna聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性将探针水解酶切，使得报告基团和淬灭基团分离，从而发出荧光。taqman荧光定量pcr监测到的荧光值与pcr产物的数量成正比，是一种精确的核酸检测方法。此方法克服了常规pcr定性检测的一些不足，极大地提高了检测的准确性、敏感性和特异性，在微生物检测和病原诊断中广泛应用。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种贝莱斯芽孢杆菌的特异性引物、taqman探针及实时荧光定量pcr检测方法。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种贝莱斯芽孢杆菌的特异性引物和taqman探针，所述特异性引物的核苷酸序列为：velezensisdetection-f：5’-ccagacttgataagattctc-3’，

4、velezensis detection-r：5’-tgaccactttatgataacg-3’；

5、所述taqman探针的核苷酸序列为：

6、velezensis detection-probe：5’-fam-tcggaacaggaatcggagaaga-tamra-3’。

7、上述一种特异性引物和taqman探针在制备贝莱斯芽孢杆菌的检测试剂盒中的应用。

8、一种贝莱斯芽孢杆菌荧光定量pcr检测试剂盒，所述试剂盒包括上述的特异性引物和taqman探针。

9、进一步的，上述试剂盒还包括核酸扩增试剂、阳性对照、阴性对照，所述阳性对照为含有贝莱斯芽孢杆菌的rpod基因的peasy-blunt-rpod质粒，所述阴性对照为灭菌超纯水。

10、进一步的，上述peasy-blunt-rpod质粒是将序列如seq id no.6所示的贝莱斯芽孢杆菌rpod基因连接至peasy-blunt zero载体获得。

11、进一步的，上述试剂盒的荧光定量pcr反应体系为：10mm velezensis detection-f0.4μl，10mm velezensis detection-r 0.4μl，10mm velezensis detection-probe 0.4μl，premix ex-taq(probe qpcr)10μl，双蒸水7.8μl，待测样品dna模板1μl。

12、进一步的，上述试剂盒的荧光定量pcr反应程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性5s，58℃退火15s，72℃延伸30s，共40个循环。

13、一种非诊断性的利用上述试剂盒检测贝莱斯芽孢杆菌的荧光定量pcr方法，包括以下步骤：

14、s1：从待测样品中提取细菌dna；

15、s2：对提取的细菌dna进行荧光定量pcr扩增；

16、其中，荧光定量pcr扩增的反应体系为：10mm velezensis detection-f 0.4μl，10mm velezensis detection-r 0.4μl，10mm velezensis detection-probe 0.4μl，premix ex-taq(probe qpcr)10μl，双蒸水7.8μl，待测样品dna模板1μl；

17、荧光定量pcr扩增的反应程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性5s，58℃退火15s，72℃延伸30s，共40个循环；

18、s3：收集待测样品荧光信号，对荧光信号进行数据处理，得到ct值及扩增曲线，对待测样品进行定性和定量检测。

19、本发明的显著优点在于：

20、1)操作简单、耗时短。本发明通过优化反应体系，将pcr反应的各组分配成预混液，在试剂操作过程中只需向反应管中加入预混液和待测样品dna，操作简单；通过优化反应条件，检测可在1h内完成，极大缩短检测时间。

21、2)灵敏度高。本发明对贝莱斯芽孢杆菌rpod基因的检测极限可低至181拷贝/μl，具有较高的灵敏度。

22、3)特异性强。本发明提供的检测方法是针对贝莱斯芽孢杆菌rpod基因taqman探针法，除加入引物外还增加一条特异性探针，当引物和探针都与靶基因结合时，扩增时探针才会被水解酶切发出荧光。相比于染料法，探针法避免了引物二聚体的荧光信号干扰，提升了检测的准确度。且本检测方法设计的引物，无法识别海水养殖中常见的其它病原菌，如嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、变形假单胞菌、溶藻弧菌、诺卡氏弧菌、荧光假单胞菌和铜绿假单胞菌等，具有较好的特异性；

技术特征：

1.一种贝莱斯芽孢杆菌的特异性引物和taqman探针，其特征在于：所述特异性引物的核苷酸序列为：

2.如权利要求1所述的特异性引物和taqman探针在制备贝莱斯芽孢杆菌的检测试剂盒中的应用。

3.一种贝莱斯芽孢杆菌荧光定量pcr检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的特异性引物和taqman探针。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括核酸扩增试剂、阳性对照、阴性对照，所述阳性对照为含有贝莱斯芽孢杆菌的rpod基因的peasy-blunt-rpod质粒，所述阴性对照为灭菌超纯水。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述peasy-blunt-rpod质粒是将序列如seq id no.6所示的贝莱斯芽孢杆菌rpod基因连接至peasy-blunt zero载体获得。

6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的荧光定量pcr反应体系为：10mm velezensis detection-f 0.4μl，10mm velezensis detection-r 0.4μl，10mmvelezensis detection-probe 0.4μl，premix ex-taq（probe qpcr）10μl，双蒸水7.8μl，待测样品dna模板1μl。

7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的荧光定量pcr反应程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性5s，58℃退火15s，72℃延伸30s，共40个循环。

8.一种非诊断性的利用权利要求3所述试剂盒检测贝莱斯芽孢杆菌的荧光定量pcr方法，其特征在于：包括以下步骤：

技术总结
本发明提供了一种贝莱斯芽孢杆菌的特异性引物、Taqman探针及实时荧光定量PCR检测方法，属于微生物PCR检测技术领域。所述特异性引物的核苷酸序列为：Velezensisdetection‑F：5’‑CCAGACTTGATAAGATTCTC‑3’，Velezensis detection‑R：5’‑TGACCACTTTATGATAACG‑3’；所述Taqman探针的核苷酸序列为：Velezensis detection‑Probe：5’‑FAM‑TCGGAACAGGAATCGGAGAAGA‑TAMRA‑3’。本发明克服了传统细菌培养和鉴定方法的不足，极大地提高了检测的准确性、敏感性和特异性，检测极限达到181拷贝/μL。且操作简单，可应用于对海水养殖水生经济动物以及养殖水体中贝莱斯芽孢杆菌的准确、定量地跟踪监测，评估贝莱斯芽孢杆菌益生菌产品在生物体上的定植效果，具有很高的实用价值。

技术研发人员：陈新华,覃盼,杨景松,陈兴甫
受保护的技术使用者：福建农林大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/29