一种与葡萄裂果基因紧密连锁的SNP分子标记及其获得方法和应用

本发明属于生物遗传育种，具体公开了一种与葡萄裂果基因紧密连锁的snp分子标记及其获得方法和应用。

背景技术：

1、葡萄裂果是果实成熟或发育过程中果皮开裂，导致果品腐烂及提前脱落而丧失商品价值的一种生理病害现象，葡萄采收前易发生裂果现象，尤其在果实成熟后期的多雨年份更为严重。大量研究指出果实裂果受品种遗传特性和环境因素共同影响，品种间存在明显地裂果敏感性差异，在新疆种植面积较广的一些欧亚种(木纳格、无核白、无核紫等)成熟期果皮极易开裂，成熟期遇到降雨时裂果现象尤其严重(木纳格部分年份裂果率高达70％)，导致种植效益显著降低甚至亏损，严重制约了鲜食葡萄产业的健康发展，近年来新疆葡萄裂果现象严重。给农民造成巨大损失，成为生产上亟待解决的关键问题。

2、优良品种是巩固和发展葡萄产业的重要抓手。要从根本上解决该科学问题，还需从种源入手，选育不裂果的品种尤为重要。新疆乡土葡萄如无核白、木纳格等，在2400多年种植的过程中积累了大量的体细胞变异材料，是研究遗传改良、育种中间材料或筛选新品种的重要种质资源，具有其不可替代的优异基因，充分挖掘利用这些乡土葡萄的关键农艺性状的基因资源、创新现代育种技术、对培育优良新品种至关重要。目前葡萄主要以杂种育种为主，胚挽救为辅，分子辅助育种技术应用滞后，尤其缺乏具有育种价值的关键基因和编辑靶位点，种质创新技术效率不高；生产上主栽品种存在裂果现象严重等关键问题，严重影响葡萄产业的高质量发展。因此，开展葡萄基关键性状分子标记开发，为加速育种进程提供技术支撑。

3、由于生物的遗传多样性，研究人员一直在不懈努力寻找个体及群落之间的差异，从而为能更好的解读遗传的复杂过程和本质。传统育种受限于周期长、占地面积大、杂交育种效率低等问题，短期内难以选育出满足人们需求的优良新品种。近年来，在高通量测序技术的发展和推动下，果树及葡萄基因组学研究取得了突破性进展，为重要性状的遗传定位和功能基因挖掘提供了新的机遇，同时也为克服传统葡萄育种周期长、效率低等难题提供了新的希望和路径。snp(single nucleotide polymorphism)，即为单核苷酸多态性，是基于全基因组重测序技术的覆盖整个基因组的高密度snp标记，是继rflp和ssr等标记之后最具有发展潜力的第三代分子标记，通常呈双等位基因多态性，一般有2个等位基因和3种基因型，又称为双等位基因标记(biallelic marker)。并根据多态性，可绘制出插入或缺失的遗传图谱，同时也可通过分析pcr产物大小，来有效鉴别各个体的基因型。相对于ssr标记，snp标记在基因组中覆盖率更广，基于全基因组重测序技术的覆盖整个基因组的高密度snp标记，其具有snp数量多、分布广泛、标记适于规模化快速筛查、精度高、snp等位基因频率的容易估计和易于基因分型的优点。在定位目标基因、构建高密度遗传图谱和分子标记辅助育种等方面，具有更大的使用价值和发展空间。

4、目前，开发出来的分子标记为构建高密度的分子遗传图谱提供了重要保障。但由于分子标记技术使用成本较高、不易操作、很难获得有效地分子标记，虽然分子标记辅助选择被认为是作物改良中表型选择最有效的替代手段，在寻找与性状连锁的分子标记方面也投入了巨大的资金，但是至今为止分子标记辅助选择应用依然滞后，还没有被作为一个常规程序应用到大多数葡萄育种项目中。因此，在进行葡萄分子标记开发的时候，要力争获得信息量大、操作简单和使用成本低的分子标记。新疆乡土葡萄品种是两千多年筛选保留下来的适应新疆地域的优异和宝贵的种质资源。其中木纳格葡萄是最具新疆特色的优质乡土品种，曾在博览会上摘得金奖，引起国内外葡萄专家和种植者的重视，区外虽大量引种尚无商业种植成功的报道。我们利用全基因组重测序技术对木纳格及其后代进行重测序变异检测、snp注释及分析、性状相关snp标记开发、验证及应用，深入解析木纳格及其后代的遗传多样性和结构特征，从而为木纳格及其后代优异性状挖掘、全基因组关联分析及今后定向育种提供科学依据。

技术实现思路

1、为了解决背景技术中存在的实际问题，本申请提供并揭示了一种与葡萄裂果基因紧密连锁的snp分子标记，并提供了一种操作简单，成本低廉的获取该特异性dna片段的方法，从而深刻的打开了该分子标记开发利用的应用场景和想象空间，为基于克隆基因的实际应用奠定了基础。

2、具体技术方案如下：

3、一、一种与葡萄裂果基因紧密连锁的snp分子标记引物，所述snp分子标记引物具有如seq id no.1、2、5、6所示的序列。

4、二、一种与葡萄裂果基因紧密连锁的snp分子标记的获取方法，所述方法以裂果葡萄木纳格(新疆乡土主栽品种，在主产区阿图什)为母本，以不裂果的葡萄茉莉莎无核(国外引进品种)为父本，构建杂交后代m10的f1代，通过全基因组重测序，检测裂果亲本、不裂果亲本、裂果和不裂基因组间特定位置的特异性dna片段，筛选存在snp位点多态性的特异性dna片段；通过关联分析，获得与葡萄裂果基因相关联的snp位点；利用snp位点所在的特异性dna片段，设计snp分子标记的特异性引物对，获得与葡萄裂果基因紧密连锁的snp分子标记。

5、三、一种与葡萄裂果基因紧密连锁的snp分子标记的应用，该snp分子标记可应用于葡萄不易裂果品系的辅助选择育种。

6、四、一种检测与葡萄裂果基因紧密连锁的snp位点的试剂盒，所述试剂盒含有上述序列如seq id no.1、2、5、6所示的特异性引物对。

7、本发明的积极性效果及应用如下：

8、1、本发明使用的pcr扩增及测序体系，不需要特殊的pcr和测序仪器，普通的实验室均能达到要求；2、本发明获得与葡萄裂果基因紧密连锁的snp位点及标记，是在对葡萄易裂果品种木纳格、不易裂果的葡萄茉莉莎无核及其f1遗传群体分析而获得的新标记，该标记与葡萄裂果基因紧密连锁，pcr扩增重复性好，稳定性强，可以用于葡萄不易裂果新品种鉴定和葡萄不易裂果后代的分子辅助选择，进而加快品种不裂果的育种进程；3、为克隆葡萄裂果基因、基因序列分析以及转裂果基因的葡萄研究奠定了良好的基础。

技术特征：

1.一种与葡萄裂果基因紧密连锁的snp分子标记引物，其特征在于，所述snp分子标记引物具有如seq id no.1、2、5、6所示的序列。

2.由权利要求1中snp分子标记引物扩增获得的snp分子标记。

3.一种与葡萄裂果基因紧密连锁的snp分子标记的获取方法，其特征在于，所述获取方法以裂果葡萄木纳格为母本，以不裂果的葡萄茉莉莎无核为父本，构建杂交后代m10的f1代，不裂果的葡萄茉莉莎无核的亲本克瑞森无核，通过全基因组重测序对以上4个品种进行测序，检测裂果亲本、不裂果亲本、裂果和不裂基因组间特定位置的特异性dna片段，筛选存在snp位点多态性的特异性dna片段；通过关联分析，获得与葡萄裂果基因相关联的snp位点；利用snp位点所在的特异性dna片段，设计snp分子标记的特异性引物对，获得与葡萄裂果基因紧密连锁的snp分子标记。

4.一种与葡萄裂果基因紧密连锁的snp分子标记的应用，其特征在于，将所述分子标记用于葡萄不裂果品系的辅助选择育种；所述分子标记为权利要求2中所述的snp分子标记。

5.一种检测与葡萄裂果基因紧密连锁的snp位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1中所述的snp分子标记引物。

技术总结
本发明属于生物技术工程和葡萄育种技术领域，具体公开一种与葡萄裂果基因紧密连锁的SNP分子标记及其获得方法和应用，SNP位点是在全基因组测序基础上，通过关联分析、试验验证而获得；由2个SNP标记位点组成，这些SNP分子标记组合可用于葡萄裂果性状的分子标记辅助育种，在早期可以直接在基因组水平上选育个体，不依赖表型信息，可显著提高葡萄抗裂果性状选择效率，加快育种进程，节省中间杂交苗栽培管理费用，提高了育种效率，降低了育种成本，具有广泛的应用前景。

技术研发人员：钟海霞,张付春,伍新宇,张雯,周晓明,吴久赟,王敏,韩守安,张川,张松霖
受保护的技术使用者：新疆农业科学院园艺作物研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15