一种抗人磷酸化tau181兔单克隆抗体及其应用的制作方法

本申请涉及免疫检测，具体涉及抗人磷酸化tau181兔单克隆抗体及其应用。

背景技术：

1、阿尔茨海默病(alzheimer disease，ad)，是一种起病隐匿的、进展性的神经退行性病变，临床表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状等，其典型的组织病理学改变为β淀粉样蛋白(amyloidβ-protein，aβ)的沉积导致老年斑，tau蛋白异常磷酸化引起的神经纤维缠结、神经元和突触的丢失。ad不但严重影响患者的社交、职业和生活功能，同时给患者家庭和社会带来巨大的精神压力和沉重的经济负担。

2、tau蛋白是人体第17号染色体编码的蛋白，广泛存在于生物体内，尤其是神经系统，该蛋白是组成微管的主要成分，具有促进微管组装和维持微管稳定的功能。在ad发病过程中，微管结构发生变化，微管结构的完整性遭到破坏，促使微管蛋白的解离，稳定性受到破坏。而与微管结合的tau蛋白也发生变化，过度磷酸化的tau蛋白全部或部分丧失了其生物学活性，不仅自身与微管蛋白的结合力下降，还与正常微管蛋白竞争性地与微管结合，从而使微管解聚，导致始于神经元突起末端的神经元退行性病变，最终导致神经元死亡和ad的发生。

3、根据磷酸位点的不同，p-tau主要有p-tau181、p-tau231、p-tau217等，检测血清中p-tau181的含量对诊断ad有着较高的临床价值。《中国阿尔兹海默病痴呆诊疗指南(2020年版)》指出，在ad鉴别诊断的常规检查流程中，应推荐血液常规、生化和血清学检查，在血液检查中p-tau181浓度可作为区分ad与非ad痴呆的生物标志物。

4、目前，多采用elisa检测试剂盒对tau蛋白的磷酸化进行检测，即需要特异性识别p-tau181的单克隆抗体，现有技术中有抗人磷酸化tau181鼠单克隆抗体及检测方法，但是并未有兔单克隆抗体及检测方法的报道，因此，亟需能够对血液p-tau181实现特异性好、亲和力高的抗人磷酸化tau181兔单克隆抗体及检测方法，在整个临床进程中用于阿尔茨海默病的筛查和诊断。

技术实现思路

1、为了克服上述技术问题，本申请提供了特异性好、亲和力高的抗人磷酸化tau181兔单克隆抗体，及其在双抗体夹心elisa或化学发光法制备的免疫检测试剂盒中的应用，为与人磷酸化tau181相关的阿尔兹海默症提供辅助诊断。

2、第一方面，本申请提供了一种抗人磷酸化tau181的兔单克隆抗体，所述兔单克隆抗体包括轻链可变区和重链可变区。

3、所述轻链可变区包含lcdr1-3，所述lcdr1包含如seq id no:3所示的氨基酸序列，所述lcdr2包含如seq id no:4所示的氨基酸序列，所述lcdr3包含如seq id no:5所示的氨基酸序列；

4、所述重链可变区包含hcdr1-3，所述hcdr1包含如seq id no:6所示的氨基酸序列，所述hcdr2包含如seq id no:7所示的氨基酸序列，所述hcdr3包含如seq id no:8所示的氨基酸序列。

5、可选地，所述轻链可变区包含如seq id no:1所示的氨基酸序列，vl全长为106个氨基酸，其fr的4个结构域氨基酸数分别为23、17、36和10，lcdr的3个结构域氨基酸数分别为9、3和8，lcdr1、lcdr2和lcdr3的区域相应地分别为24aa-32aa，50aa-52aa和89aa-96aa，其氨基酸序列分别：qasqnvynn(seq id no.3)、eas(seq id no.4)、aggysrts(seq idno.5)。

6、所述重链可变区包含如seq id no:2所示的氨基酸序列，vh全长为113个氨基酸，其fr的4个结构域氨基酸数分别为24、17、38和11，hcdr的3个结构域氨基酸数分别为8、7和12，hcdr1、hcdr2和hcdr3分别为25aa-32aa，50aa-56aa和95aa-102aa，其氨基酸序列分别为gfplsnya(seq id no.6)、igssgst(seq id no.7)、arsypgys(seq id no.8)。

7、第二方面，本申请还提供了编码第一方面中抗人磷酸化tau181的兔单克隆抗体的分离的多核苷酸。

8、第三方面，本申请还提供了一种重组表达载体，其含有本申请第二方面所述的多核苷酸。

9、第四方面，本申请还提供了含有第三方面所述的重组表达载体的宿主细胞，优选地，所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞。

10、第五方面，本申请还提供了一种检测人磷酸化tau181的免疫检测产品，所述免疫检测产品包括本申请第一方面所述的兔单克隆抗体。

11、可选地，所述免疫检测产品为检测试剂盒、芯片或检测试纸。

12、第六方面，本申请还提供了第一方面所述的兔单克隆抗体在制备检测人磷酸化tau181蛋白的免疫检测产品中的应用。

13、可选地，所述免疫检测产品为检测试剂盒、芯片或检测试纸。

14、可选地，所述检测试剂盒为双抗体夹心elisa检测试剂盒或化学发光免疫检测试剂盒。

15、相对于现有技术而言，本申请的抗人磷酸化tau181的兔单克隆抗体可以与人磷酸化tau181蛋白高特异性结合，并具有高亲和力，其亲和常数ka可达5.9×108l/mol。本申请的抗人磷酸化tau181的兔单克隆抗体还可以制备成检测磷酸化tau181的各种免疫检测试剂盒，尤其是，应用于双抗体夹心elisa或化学发光法制备的免疫检测试剂盒中。双抗体夹心elisa检测人磷酸化tau181标准抗原，检测灵敏度小于75pg/ml；磁微粒化学发光法检测人磷酸化tau181标准抗原，检测灵敏度最低能达到50pg/ml。

技术特征：

1.一种抗人磷酸化tau181的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含lcdr1-3，所述lcdr1包含如seq id no:3所示的氨基酸序列，所述lcdr2包含如seq id no:4所示的氨基酸序列，所述lcdr3包含如seq idno:5所示的氨基酸序列；所述重链可变区包含hcdr1-3，所述hcdr1包含如seq id no:6所示的氨基酸序列，所述hcdr2包含如seq id no:7所示的氨基酸序列，所述hcdr3包含如seq idno:8所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的兔单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区包含如seq idno:1所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如seq id no:2所示的氨基酸序列。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，编码权利要求1-2中任一所述的兔单克隆抗体。

4.一种重组表达载体，其特征在于，其含有权利要求3所述的多核苷酸。

5.一种宿主细胞，其特征在于，其含有权利要求4所述的重组表达载体，所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞。

6.一种人磷酸化tau181的免疫检测产品，其特征在于，所述免疫检测产品包括权利要求1或2所述的兔单克隆抗体。

7.根据权利要求6所述的免疫检测产品，其特征在于，所述免疫检测产品为检测试剂盒、芯片或检测试纸。

8.权利要求1或2所述的兔单克隆抗体在制备检测人磷酸化tau181蛋白的免疫检测产品中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述免疫检测产品为检测试剂盒、芯片或检测试纸。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述检测试剂盒为双抗体夹心elisa检测试剂盒或化学发光免疫检测试剂盒。

技术总结
本申请属于免疫检测技术领域，公开了一种抗人磷酸化tau181兔单克隆抗体及其应用。本申请提供的抗人磷酸化tau181兔单克隆抗体，包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的LCDR1包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，LCDR2包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，LCDR3包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；所述重链可变区的HCDR1包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，HCDR2包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，HCDR3包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。本申请的兔单克隆抗体可与人磷酸化tau181蛋白高特异性结合，将其应用于双抗体夹心ELISA或化学发光法制备的免疫检测试剂盒中，双抗体夹心ELISA检测人磷酸化tau181标准抗原，检测灵敏度小于75 pg/ml，磁微粒化学发光法检测人磷酸化tau181标准抗原，检测灵敏度能达到50 pg/ml。

技术研发人员：扈晓敏,柳孟姣,钮倩,吴娜,王剑,任琪,W·付,张杨
受保护的技术使用者：无锡傲锐东源生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/4