灭幼脲半抗原、抗原、抗体、检测装置及其制备和应用的制作方法

本发明涉及食品安全的免疫学检测，更具体地，本发明涉及灭幼脲半抗原、抗原、抗体、检测装置及其制备和应用，其检测装置特别适用于蔬菜、水果中灭幼脲残留的快速检测。

背景技术：

1、灭幼脲为苯甲酰脲类几丁质合成抑制剂，主要通过抑制昆虫表皮几丁质合成酶和尿核苷辅酶的活性，从而抑制昆虫几丁质合成导致其死亡，对蚊蝇幼虫有较高的活性，也可抑制双翅目成虫卵的孵化。然而，长期食用含灭幼脲的食品会对人体产生一定的损伤。国家标准gb2763-2021《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》，规定果蔬中灭幼脲的最大残留量分别为0.2-30mg/kg。因此，有必要对水果、蔬菜、谷物中灭幼脲的残留量进行控制。

2、由于蔬菜基质比较复杂，测定前需要对其进行前处理，目前采用的方法主要为固相萃取法，但用其分析复杂基质样品或不同性质多农药残留时，可能引起回收率偏低，主要由气相色谱仪或液相色谱仪进行检测，但过程较复杂，成本较高，很难达到快速检测的目的，不适用于现场快速检测，不能满足监管部门、检测机构现场监督执法的需要。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供了灭幼脲半抗原、抗原、抗体、检测装置及其制备和应用。

2、为解决上述的技术问题，本发明采用以下技术方案：

3、根据本发明的一个方面，提供了灭幼脲半抗原，其结构如式(ⅰ)所示：

4、

5、根据本发明的另一个方面，制备灭幼脲半抗原的方法，包括以下步骤：

6、s1.冰浴下在氨水溶液中滴加2-氯苯甲酰氯，反应2h后将白色沉淀抽滤、水洗烘干得到第一中间体2-氯苯甲酰胺；

7、s2.将对硝基苯酚、4-溴丁酸叔丁酯用dmf溶解，溶解后加入碳酸钾，80℃搅拌反应6h，反应结束后蒸干溶剂，加水稀释，乙酸乙酯萃取，有机相蒸干过柱纯化得第二中间体，第二中间体的结构式如式(ⅱ)所示：

8、

9、s3.用水合肼、pd/c和三氯化铁加入甲醇溶解的第二中间体中，经过纯化，得到第三中间体，第三中间体的结构式如式(ⅲ)所示：

10、

11、s4.将第一中间体用1，2-二氯乙烷溶解，溶解后加入草酰氯，70℃搅拌反应6h后蒸干溶剂，再次加入1，2-二氯乙烷作为溶剂，滴加第三中间体，70℃保温反应过夜，反应后蒸干溶剂，重结晶后得到第四中间体，第四中间体的结构式如式(iv)所示：

12、

13、s5.将第四中间体用二氯甲烷溶解，溶解后加入三氟乙酸，室温搅拌反应1h后蒸干溶剂，得到结构如式(ⅰ)所示的半抗原。

14、在一些实施方式中，所述步骤s1中，2-氯苯甲酰氯与氨水的摩尔比为1:(1-10)；

15、所述步骤s2中，对硝基苯酚、4-溴丁酸叔丁酯与碳酸钾的摩尔比为1:(1.2-2):(1.5-5)。在一些实施方式中，所述步骤s4中，所述步骤s4中，第一中间体与草酰氯、第三中间体的摩尔比为1:(1-1.2):(1-1.2)。

16、根据本发明的再一个方面，提供了灭幼脲抗原，包含灭幼脲半抗原以及与灭幼脲半抗原偶联的载体蛋白，载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白中的一种。

17、根据本发明的第四个方面，提供了灭幼脲抗体，是由灭幼脲抗原经动物免疫制备得到，灭幼脲抗体为灭幼脲单克隆抗体。

18、根据本发明的第五个方面，提供了灭幼脲半抗原、灭幼脲抗原、灭幼脲抗体在灭幼脲的免疫学检测中的应用。

19、根据本发明的第六个方面，提供了灭幼脲胶体金层析检测装置，检测装置包括试纸条和微孔反应杯，试纸条包括反应膜、样品吸收垫、吸水垫和底板，反应膜设有检测线和质控线，检测线包被有灭幼脲抗原，质控线包被有羊抗鼠抗体，微孔反应杯中含有胶体金标记的灭幼脲抗体。

20、根据本发明的第七个方面，提供了一种检测样品中灭幼脲残留的方法，该方法为使用灭幼脲胶体金层析检测装置对样品中的灭幼脲进行检测，该方法包括以下步骤：

21、1)样品前处理；

22、2)用灭幼脲胶体金层析检测装置进行检测；

23、3)分析检测结果。

24、在一些实施方式中，所述样品为蔬菜或水果。

25、与现有技术相比，本发明的至少具有以下有益效果之一：

26、(1)本发明提供的灭幼脲半抗原的制备方法，使用的化学试剂容易得到、操作过程简单、合成步骤简洁有效、反应产率较高、并且检测成本较低。

27、(2)本发明利用层析式免疫胶体金原理，通过检测卡中检测线与质控线之间的比色来定性检测样本中是否残留有灭幼脲，应用时不需要使用液相色谱或质谱等大型仪器，达到快速检测的目的。

28、(3)本发明应用免疫学检测方法，对样品中残留的灭幼脲进行专属检测，具有特异性好、灵敏度高、操作简便、可实现现场快速检测等优点，能更好的满足监管部门、检测机构现场监督执法的需要，为相关执法部门快速检测蔬菜或水果中是否残留灭幼脲提供技术支持。

技术特征：

1.灭幼脲半抗原，其特征在于，其结构如式(ⅰ)所示：

2.制备权利要求1所述的灭幼脲半抗原的方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2的制备灭幼脲半抗原的方法，其特征在于，所述步骤s1中，2-氯苯甲酰氯与氨水的摩尔比为1:(1-10)；

4.根据权利要求2的制备灭幼脲半抗原的方法，其特征在于，所述步骤s4中，第一中间体与草酰氯、第三中间体的摩尔比为1:(1-1.2):(1-1.2)。

5.灭幼脲抗原，其特征在于，灭幼脲抗原包含权利要求1所述的灭幼脲半抗原以及与所述灭幼脲半抗原偶联的载体蛋白，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白中的一种。

6.灭幼脲抗体，其特征在于：所述幼脲抗体是由灭幼脲抗原经动物免疫制备得到，所述灭幼脲抗体为灭幼脲单克隆抗体。

7.权利要求1所述的灭幼脲半抗原、权利要求5所述的灭幼脲抗原、权利要求6所述的灭幼脲抗体在灭幼脲的免疫学检测中的应用。

8.灭幼脲胶体金层析检测装置，所述检测装置包括试纸条和微孔反应杯，所述试纸条包括反应膜、样品吸收垫、吸水垫和底板，所述反应膜设有检测线和质控线，所述检测线包被有权利要求5所述的灭幼脲抗原，所述质控线包被有羊抗鼠抗体，所述微孔反应杯中含有胶体金标记的权利要求6所述的灭幼脲抗体。

9.一种检测样品中灭幼脲残留的方法，其特征在于，所述方法为使用权利要求8所述的灭幼脲胶体金层析检测装置对样品中的灭幼脲进行检测，所述方法包括以下步骤：

10.根据权利要求9所述的一种检测样品中灭幼脲残留的方法，所述样品为蔬菜或水果。

技术总结
本发明公开了灭幼脲半抗原、抗原、抗体、检测装置及其制备和应用，涉及灭幼脲半抗原、灭幼脲抗原、灭幼脲抗体和灭幼脲胶体金层析检测装置及其制备和检测灭幼脲的应用。本发明应用免疫学检测方法，对样品中残留的灭幼脲进行专属检测，具有特异性好、灵敏度高、操作简便、可实现现场快速检测等优点，能更好的满足监管部门、检测机构现场监督执法的需要，为相关执法部门快速检测蔬菜、水果中是否残留灭幼脲提供技术支持。

技术研发人员：李向阳,吴江,宋洁,李聪平,刘威,潘修敏,李胜永,宁勤功,梁纯,李梦娇,刘政宏,马银河
受保护的技术使用者：中国烟草云南进出口有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/29