一种基于251位点的S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体及其应用

本发明属于生物工程，特别涉及一种基于251位点的s-腺苷蛋氨酸合成酶突变体，还涉及上述突变体的应用。

背景技术：

1、s-腺苷蛋氨酸(sam)，英文名为s-adenosyl-methionine，是动物、植物等生命体内重要的代谢中间物质，也是人体内一种重要的生理活性物质，参与多种生化反应，如作为胞内甲基供体，sam在核酸、蛋白质以及脂类等分子的甲基化修饰中扮演重要角色。同时，sam还参与胞内的转硫基反应以及聚胺的合成等重要生化反应。sam也是一种非常有价值的医药分子，在治疗肝病、抑郁症和风湿性关节炎中发挥重要作用。

2、sam是由底物l-甲硫氨酸和atp经s-腺苷甲硫氨酸合成酶酶促合成，因此，s-腺苷蛋氨酸合成酶是合成sam的关键酶。目前腺苷蛋氨酸工业化生产工艺主要有酵母发酵法和酶促转化法两种。国外多采用特殊培育的表达sam的酿酒酵母菌株通过胞内表达制备sam。国内有人研究出基因工程改构的酿酒酵母，发酵表达sam，但目前表达最高的也只达到10g/l发酵液以内，且发酵液中腺苷蛋氨酸的纯度较低，造成整体收率偏低，生产成本仍然较高。酶促法多以从啤酒酵母或其他工程菌中提取纯化腺苷蛋氨酸合成酶，然后通过优化酶促反应条件来转化制备sam，该法原料转化率高，sam易于提取纯化，但是该法中仍然存在酶的催化效率低、整体生产成本高等问题。

技术实现思路

1、为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种s-腺苷蛋氨酸合成酶突变体。本发明通过挖掘获得高效的s-腺苷蛋氨酸合成酶，并通过基因工程手段对其进行改造，获得s-腺苷蛋氨酸合成酶突变体，该s-腺苷蛋氨酸合成酶突变体合成s-腺苷蛋氨酸的活力和产率显著提高。

2、本发明s-腺苷蛋氨酸合成酶突变体的野生菌来源于guyparkeria sp.xi15，经定点突变获得与酶催化活性相关的核心氨基酸发生突变的突变体。

3、本发明提供的s-腺苷蛋氨酸合成酶突变体，与seq id no:1所示的氨基酸序列具有80％以上的同源性(较佳地≥90％，更佳地≥95％)，且所述突变体具有合成s-腺苷蛋氨酸的能力，并且催化活性显著提高。

4、本发明提供一种s-腺苷蛋氨酸合成酶突变体，在对应于seq id no:1的氨基酸序列的第1至390位中仅存在第22，123，244，251，266，307内的单个位点突变。

5、优选的，上述突变体在对应于seq id no:1的氨基酸序列的第1至390位中仅存在下述之一的突变：d22s；g123d；d244a；k251i；g266s；a307s；其氨基酸序列为seq id no:3-8之一所示。

6、所述的seq id no:1所示的氨基酸序列的编码基因为seq id no:2所示的核苷酸序列。

7、本发明还提供上述突变体的编码基因，其基因序列如no:9-14所示；进一步提供含所述基因的表达载体、重组细胞。

8、本发明所述的s-腺苷蛋氨酸合成酶突变体，其制备方法包括如下步骤：

9、(1)合成seq id no:1所示的氨基酸序列的编码基因，得到seq id no:2所示的核苷酸序列；

10、(2)将seq id no:2所示的核苷酸序列进行定点突变，得到seq id no:3-8的编码基因；

11、(3)将seq id no:3-8的编码基因中增加可溶性标签，其蛋白序列如下：

12、mspilgywkikglvqptrllleyleekyeehlyerdegdkwrnkkfelglefpnlpyyidgdvkltqsmaiiryiadkhnmlggcpkeraeismlegavldirygvsriayskdfetlkvdflsklpemlkmfedrlchktylngdhvthpdfmlydaldvvlymdpmcldafpklvcfkkrieaipqidkylksskyiawplqgwqatfgggdhppk，然后进行基因克隆，得到含有融合可溶性标签s-腺苷蛋氨酸合成酶突变体编码基因的质粒；

13、(4)将含有增加可溶性标签后的s-腺苷蛋氨酸合成酶突变体编码基因的质粒导入感受态细胞中，得到s-腺苷蛋氨酸合成酶突变体的表达菌株；

14、(5)s-腺苷蛋氨酸合成酶突变体的表达菌株进行诱导发酵，得到s-腺苷蛋氨酸合成酶突变体。

15、本发明还提供了利用s-腺苷蛋氨酸合成酶突变体制备的s-腺苷蛋氨酸。

16、上述s-腺苷蛋氨酸，是以表达所述s-腺苷蛋氨酸合成酶突变体的编码基因的工程菌经发酵培养到一定程度，然后进行细胞破壁得到粗酶液，在粗酶液中添加蛋氨酸和atp前体物质，在ph6.5-7.2，温度25-30℃条件下进行催化反应获得的。

17、优选的，上述粗酶液的浓度为20-30g/l。

18、优选的，上述的前体atp添加浓度为80-110g/l，蛋氨酸的添加浓度为30-35g/l，总反应时间为5-10h。

19、本发明开发了能够高效催化s-腺苷蛋氨酸的s-腺苷蛋氨酸合成酶突变体。本发明从一级结构至高级结构多角度多层系比较了genbank中id为wp_058573953.1的s-腺苷蛋氨酸合成酶(氨基酸序列如seq id no:1所示)与同源酶蛋白的异同，确定了影响s-腺苷蛋氨酸合成酶酶学性质的关键氨基酸位点为第22，123，244，251，266，307位氨基酸，然后通过密码子替换将这些位点进行如下突变：d22s；g123d；d244a；k251i；g266s；a307s，得到s-腺苷蛋氨酸合成酶突变体；通过构建突变体基因的6×his融合表达载体并导入基因工程菌e.coli bl21(de3)中诱导表达，获得了突变体酶蛋白。

20、本发明提供了一种s-腺苷蛋氨酸合成酶突变体，其蛋白为非天然蛋白，并具有高效催化s-腺苷蛋氨酸合成的特点。本发明s-腺苷蛋氨酸合成酶突变体是在genbank id:wp_058573953.1的s-腺苷蛋氨酸合成酶的第22，123，244，251，266，307位氨基酸发生突变得到的。

21、本发明的有益效果：

22、1.本发明制备的s-腺苷蛋氨酸合成酶突变体较野生型具有高效催化s-腺苷蛋氨酸合成的特点，产率能够达到25.7g/l、过程产品纯度可达到89.7％；

23、2.本发明的s-腺苷蛋氨酸合成酶添加了可溶性标签，显著提高了酶的可溶性表达，与未加可溶性标签相比，获得可溶性表达明显提升的突变体基因，根据图2，可溶性表达提高了70％以上。

24、3.且与背景技术中提及的制备s-腺苷蛋氨酸的方法相比，成本大幅度降低，成本约降低30％以上。

技术特征：

1.一种基于251位点的s-腺苷蛋氨酸合成酶突变体，其特征在于，所述突变体在对应于seq id no:1的氨基酸序列的第1至390位中仅存在下述的突变：k251i；其氨基酸序列为seqid no: 6所示。

2.权利要求1所述的s-腺苷蛋氨酸合成酶突变体的编码基因，其特征在于，所述编码基因的序列如seq id no: 12所示。

3.包含权利要求2所述的s-腺苷蛋氨酸合成酶突变体编码基因的表达载体。

4.包含权利要求2所述的s-腺苷蛋氨酸合成酶突变体编码基因的重组细胞。

5.权利要求1所述的s-腺苷蛋氨酸合成酶突变体在制备s-腺苷蛋氨酸中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，具体的应用方法为：是以表达所述s-腺苷蛋氨酸合成酶突变体的编码基因的工程菌经破壁后的粗酶液添加蛋氨酸和atp前体，得到s-腺苷蛋氨酸。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述粗酶液的浓度为20-30g/l，前体atp的添加浓度为80-110g/l，蛋氨酸的添加浓度为30-35g/l，反应体系的ph为6.5-7.2，反应温度为25-30℃，总反应时间为5-10h。

技术总结
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种基于251位点的S‑腺苷蛋氨酸合成酶突变体及其应用。本发明S‑腺苷蛋氨酸合成酶突变体的野生菌来源于Guyparkeria sp.XI15，经定点突变获得与酶催化活性相关的核心氨基酸发生突变的突变体；在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第1至390位中仅存在下述之一的突变：D22S；G123D；D244A；K251I；G266S；A307S；其氨基酸序列为SEQ ID NO:3‑8之一所示；本发明的S‑腺苷蛋氨酸合成酶突变体实现了在S‑腺苷蛋氨酸生物合成中的应用，使得S‑腺苷蛋氨酸的产率能够达到25.7g/L、过程产品纯度能够达到89.7%。

技术研发人员：马钦元,王辉,高秀珍,张同,沈剑,荣金雷,梁寒冰,张成国
受保护的技术使用者：山东理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/8