一种构建RNA文库的方法和试剂盒

本发明涉及生物技术及医学，特别涉及一种构建rna文库的方法。

背景技术：

1、rna二代测序技术(rnanext-generation sequencing,rna-seq)一般是高通量大规模的转录组测序技术，可以同时对几十万乃至几百万个转录rna分子进行序列测定，用于未知病原的鉴定、生物遗传进化分析、基因表达差异分析和rna合成及加工分析等。因此，rna-seq广泛用于科学研究和疾病诊断等领域，并取得了许多突破性的结果。rna文库构建是指通过逆转录和接头连接等过程将rna转化为二代测序仪可识别的双链dna的过程，是rna-seq的关键步骤。近年来出现的rna-seq建库试剂盒主要侧重于rna链特异性研究，其具体的建库过程如下：(1)片段化rna，添加dutp合成双链cdna，通过尿嘧啶u碱基区分链特异性；(2)对cdna进行末端补平修复及对cdna的3’端加腺嘌呤a碱基，保证cdna双链的3’端含有a碱基悬挂进而配合接头的3’端胸腺嘧啶t碱基实现ta连接完成建库；(3)需要设计两条单链接头并退火形成双链，且含有硫代硫酸酯键修饰，保证接头t碱基不会脱落，才能进行有效接头连接；(4)最后，在进行pcr之前还需对含有尿嘧啶u碱基的cdna第二链进行消化才能实现链特异性建库。

2、由于现有的流程需要先进行rna打断至小片段，再生成双链cdna后，最后进行双链的补平，加a，连接接头、扩增建库等步骤，所以流程较长，通常需要7～9个小时才能完成试验，建库效率低。

3、因此，有必要开发一种流程短、建库效率高的文库构建的方法和试剂盒。

技术实现思路

1、本发明目的是提供一种构建rna文库的方法，该方法能够简化建库的过程并有效降低建库成本，通过两轮带有接头序列的cdna的合成，同步完成模板的逆转录和双端接头序列的引入，并完成模板的富集，实现了低成本且快速高效的建库。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、在本发明的第一方面，提供了一种构建rna文库的方法，所述方法包括：

4、从rna样品中富集获得mrna，所述富集过程中将所述mrna打断成mrna小片段；

5、采用第一引物对所述mrna小片段进行逆转录并纯化，获得第一链cdna；

6、采用第二引物扩增所述第一链cdna并纯化，获得第二链cdna；

7、采用第三引物扩增所述二链cdna，获得rna文库；

8、其中，所述第一引物从5’端至3’端依次包括第一接头序列和随机序列；所述第二引物从5’端至3’端依次包括第二接头序列和随机序列；

9、所述第三引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物从5’端至3’端依次包括：上游测序平台序列、文库index序列以及上游测序引物序列，所述下游引物从5’端至3’端依次包括：下游测序平台序列、文库index序列以及下游测序引物序列，其中，所述上游测序引物序列与所述第二引物的5’端的至少部分序列相同，所述下游测序引物序列与所述第一引物的5’端的至少部分序列相同。

10、进一步地，所述第一接头序列和所述第二接头序列均选自p5和p7接头，且所述第一接头序列和第二接头序列不同。

11、进一步地，所述第一引物的序列如seq id no.1所示，所述第二引物的序列如seqid no.2所示，所述第三引物中的上游引物的序列如seq id no.3所示，下游引物的序列如seq id no.4所示。

12、进一步地，所述rna样品包括总rna、mrna、lncrna、去除核糖体的rna中的至少一种。

13、进一步地，所述采用第二引物扩增所述第一链cdna时，采用具有链置换功能的dna聚合酶，同时添加rnase h。

14、在本发明的第二方面，提供了构建rna文库的引物组合，所述引物组合包括第一引物、第二引物和第三引物，所述第一引物从5’端至3’端依次包括第一接头序列和随机序列；所述第二引物从5’端至3’端依次包括第二接头序列和随机序列；所述第三引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物从5’端至3’端依次包括：上游测序平台序列、文库index序列以及上游测序引物序列，所述下游引物从5’端至3’端依次包括：下游测序平台序列、文库index序列以及下游测序引物序列，其中，所述上游测序引物序列与所述第二引物的5’端的至少部分序列相同，所述下游测序引物序列与所述第一引物的5’端的至少部分序列相同。

15、进一步地，所述第一引物的序列如seq id no.1所示，所述第二引物的序列如seqid no.2所示，所述第三引物包括序列如seq id no.3所示的上游引物和序列如seq idno.4所示的下游引物。

16、在本发明的第二方面，提供了一种构建rna文库的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物组合。

17、本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

18、本发明提供一种构建rna文库的方法，通过对打断富集的mrna进行逆转录，由于mrna打断之后，第一链引物和第二链引物中的随机序列可以和模板进行多点的结合，两个引物结合位点相隔不远，便于后续pcr扩增富集，获得了高于原始模板产量的cdna，且由于两次反应分别用不同的酶和接头，两次随机引物分别结合在dna的不同链，因此获得的rna文库具有链特异性，在pcr之前产物分选使得产物长度也在测序合理范围内。，由于引物上直接连接有接头序列，无需后期再进行双端接头连接，因此无论是扩增效率还是建库速度都大幅提升。

技术特征：

1.一种构建rna文库的方法，其特征在于，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的一种构建rna文库的方法，其特征在于，所述第一接头序列和所述第二接头序列均选自p5和p7接头，且所述第一接头序列和第二接头序列不同。

3.根据权利要求1所述的一种构建rna文库的方法，其特征在于，所述第一引物的序列如seq id no.1所示，所述第二引物的序列如seq id no.2所示，所述第三引物中的上游引物的序列如seq id no.3所示，下游引物的序列如seq id no.4所示。

4.根据权利要求1所述的一种构建rna文库的方法，其特征在于，所述rna样品包括总rna、mrna、lncrna、去除核糖体的rna中的至少一种。

5.根据权利要求1所述的一种构建rna文库的方法，其特征在于，所述采用第二引物扩增所述第一链cdna时，采用具有链置换功能的dna聚合酶，同时添加rnase h。

6.一种构建rna文库的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括第一引物、第二引物和第三引物，所述第一引物从5’端至3’端依次包括第一接头序列和随机序列；所述第二引物从5’端至3’端依次包括第二接头序列和随机序列；所述第三引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物从5’端至3’端依次包括：上游测序平台序列、文库index序列以及上游测序引物序列，所述下游引物从5’端至3’端依次包括：下游测序平台序列、文库index序列以及下游测序引物序列，其中，所述上游测序引物序列与所述第二引物的5’端的至少部分序列相同，所述下游测序引物序列与所述第一引物的5’端的至少部分序列相同。

7.根据权利要求6所述的一种构建rna文库的引物组合，其特征在于，所述第一引物的序列如seq id no.1所示，所述第二引物的序列如seq id no.2所示，所述第三引物包括序列如seq id no.3所示的上游引物和序列如seq id no.4所示的下游引物。

8.一种构建rna文库的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求5-6任一项所述的引物组合。

9.根据权利要求8所述的一种构建rna文库的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括逆转录酶和dna聚合酶。

技术总结
本发明提供了一种构建RNA文库的方法，所述方法包括：从RNA样品中富集获得mRNA，所述富集过程中将所述mRNA打断成mRNA小片段；采用第一引物对所述mRNA小片段进行逆转录并纯化，获得第一链cDNA；采用第二引物扩增所述第一链cDNA并纯化，获得第二链cDNA；采用第三引物扩增所述二链cDNA，获得RNA文库；该方法能够简化建库的过程并有效降低建库成本，通过两轮带有接头序列的cDNA的合成，同步完成模板的逆转录和双端接头序列的引入，并完成模板的富集，实现了低成本且快速高效的建库。

技术研发人员：殷雷,孙再桥,雷骏,何柏晓,陈鹏
受保护的技术使用者：武汉大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/11