一种用于重组腺相关病毒包装的质粒系统及其应用的制作方法

本发明涉及生物，具体涉及一种用于重组腺相关病毒包装的质粒系统及其应用。

背景技术：

1、重组腺相关病毒(raav)作为基因治疗载体，具有安全性高、转导能力强等特点，目前已有几款基于raav的基因治疗药物上市，还有很多基于raav的基因治疗临床试验正在开展。raav生产系统主要包括基于hek293细胞的质粒转染生产系统、基于昆虫细胞和杆状病毒的生产系统、基于hek293细胞和腺病毒的生产系统。基于hek293细胞的质粒转染生产系统，可贴壁培养以及悬浮培养，同时也包括一质粒或者多质粒转染的方式，简单、快速，是被广泛采用的raav生产系统。以经典的三质粒转染生产系统为例，该生产系统涉及使用三个质粒共转染hek293细胞：一个辅助质粒phelper，提供能够表达腺病毒元件蛋白的核酸序列；一个辅助质粒prep-cap，提供能够表达aav的rep和cap蛋白的核酸序列，其中rep蛋白负责aav基因组的复制与协助aav基因组颗粒的组装，cap蛋白组成aav外壳；一个包括目的序列的质粒，可简称为pgoi，目的序列的上下游各有一个天然aav基因组中的5′itr和3′itr序列。

2、在raav生产过程中，质粒骨架核酸序列(质粒复制相关的ori核酸序列、质粒筛选相关的抗性基因核酸序列等)，会由itr/类itr介导或随机方式将其错误包装进入aav病毒衣壳，降低raav病毒的纯度和效价，带来不可预测的副作用，给体内的基因治疗带来风险。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种用于重组腺相关病毒包装的质粒系统及其应用。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供了一种用于重组腺相关病毒包装的质粒系统，所述质粒系统包括：含两个末端反向重复序列的质粒、腺病毒辅助质粒和raav重组包装质粒；所述含两个末端反向重复序列的质粒、腺病毒辅助质粒、raav重组包装质粒中的至少一种质粒中插入有基因编辑酶的靶位点序列和/或基因编辑酶序列。

4、本发明的用于raav包装的质粒系统，在raav生产过程中可以有效降低raav中质粒骨架核酸序列残留，即有效降低非raav相关序列错误包装进入aav病毒衣壳的比率，提高raav产品的纯度，从而极大的提高raav产品的成药性。

5、作为本发明所述的质粒系统的优选实施方式，所述基因编辑酶为成簇规律间隔短回文重复(crispr)/crispr associated(cas)核酸酶、转录激活子样效应子核酸酶(talen)、锌指核酸酶(zfns)中的至少一种。

6、优选的，所述基因编辑酶为cas9核酸酶。基因编辑酶可识别和结合特定的基因序列，并将其切割或重组。crispr(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats)/cas(crispr associated)系统是一种由细菌及古细菌进化形成的、用于抵御病毒和质粒入侵的适应性机制。在开发crispr/cas9系统中，cas9蛋白与人工设计的sgrna(single-guided rna)结合形成复合体，在sgrna的引导下结合到与sgrna上互补配对的20bp靶dna序列，并将靶dna切割。通过设计在在载体骨架上靠近目的dna片段的区域添加特异的的20bp靶序列+pam序列，在raav包装过程中表达cas9蛋白和sgrna，可通过sgrna引导cas9蛋白识别靶dna序列后将其切割，使含目的核酸片段与载体骨架部分相分离，从而降低由itr/类itr介导包装载体骨架的概率。

7、作为本发明所述的质粒系统的优选实施方式，所述质粒系统包括插入有所述基因编辑酶的靶位点序列的pgoi、prep-cap、phelper和插入有所述基因编辑酶序列的paavs1。

8、作为本发明所述的质粒系统的优选实施方式，所述质粒系统包括插入有cas9编辑靶位点序列的pgoi、prep-cap、phelper和插入有cas9序列的paavs1。

9、作为本发明所述的质粒系统的优选实施方式，所述质粒系统包括插入有所述基因编辑酶的靶位点序列的pgoi、prep-cap和插入有所述基因编辑酶序列的phelper。

10、作为本发明所述的质粒系统的优选实施方式，所述质粒系统包括插入有cas9编辑靶位点序列的pgoi、prep-cap和插入有cas9序列的phelper。

11、所述质粒pgoi包括来自不同血清型、itr序列及其优化的序列。所述质粒prep-cap包括来自不同血清型、表达rep蛋白的核酸序列和表达cap蛋白的核酸序列及其优化的核酸序列。所述质粒phelper包括来自不同辅助病毒质粒、表达腺病毒原件蛋白的核酸序列及其优化的序列。

12、第二方面，本发明提供了一种降低raav中质粒骨架核酸序列残留的方法，采用所述的质粒系统转染包装细胞。

13、作为本发明所述的方法的优选实施方式，所述包装细胞包括hek293、hek293t、hek293f、hek293a、hela、vero、cho中的至少一种，以及其它用于raav生产的细胞。

14、第三方面，本发明将所述的质粒系统在raav生产中应用。

15、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

16、本发明的用于raav包装的质粒系统进行raav生产，质粒骨架核酸序列(质粒复制相关的ori核酸序列、质粒筛选相关的抗性基因核酸序列等)被错误包装进入aav病毒衣壳的比例大大降低，能够降低raav中质粒骨架核酸序列残留，有效提高raav产品的纯度，从而极大的提高raav产品的成药性。

技术特征：

1.一种用于重组腺相关病毒包装的质粒系统，其特征在于，所述质粒系统包括：含两个末端反向重复序列的质粒、腺病毒辅助质粒和raav重组包装质粒；所述含两个末端反向重复序列的质粒、腺病毒辅助质粒、raav重组包装质粒中的至少一种质粒中插入有基因编辑酶的靶位点序列和/或基因编辑酶序列。

2.根据权利要求1所述的质粒系统，其特征在于，所述基因编辑酶为crispr/cas核酸酶、转录激活子样效应子核酸酶、锌指核酸酶中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的质粒系统，其特征在于，所述基因编辑酶为cas9核酸酶。

4.根据权利要求1～3任一项所述的质粒系统，其特征在于，所述质粒系统包括插入有所述基因编辑酶的靶位点序列的pgoi、prep-cap、phelper和插入有所述基因编辑酶序列的paavs1。

5.根据权利要求4所述的质粒系统，其特征在于，所述质粒系统包括插入有cas9编辑靶位点序列的pgoi、prep-cap、phelper和插入有cas9序列的paavs1。

6.根据权利要求1～3任一项所述的质粒系统，其特征在于，所述质粒系统包括插入有所述基因编辑酶的靶位点序列的pgoi、prep-cap和插入有所述基因编辑酶序列的phelper。

7.根据权利要求6所述的质粒系统，其特征在于，所述质粒系统包括插入有cas9编辑靶位点序列的pgoi、prep-cap和插入有cas9序列的phelper。

8.一种降低raav中质粒骨架核酸序列残留的方法，其特征在于，采用权利要求1～7任一项所述的质粒系统转染包装细胞。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述包装细胞包括hek293、hek293t、hek293f、hek293a、hela、vero、cho中的至少一种。

10.权利要求1～7任一项所述的质粒系统在raav生产中的应用。

技术总结
本发明属于生物技术领域，公开了一种用于重组腺相关病毒包装的质粒系统及其应用。本发明用于rAAV包装的质粒系统包括：含两个末端反向重复序列的质粒、腺病毒辅助质粒和rAAV重组包装质粒；所述含两个末端反向重复序列的质粒、腺病毒辅助质粒、rAAV重组包装质粒中的至少一种质粒中插入有基因编辑酶的靶位点序列和/或基因编辑酶序列。本发明在rAAV生产过程中可以有效降低rAAV中质粒骨架核酸序列残留，提高rAAV产品的纯度，从而极大的提高rAAV产品的成药性。

技术研发人员：李华鹏,韩靖鸾,卜晔,陈欢,代志勇,肖丹青
受保护的技术使用者：广州派真生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/31