一种甘露聚糖酶及其在苎麻脱胶中的应用

本发明涉及酶工程技术科学领域，特别是涉及一种甘露聚糖酶及其在苎麻脱胶中的应用。

背景技术：

1、苎麻纤维的成分被划分为纤维素和非纤维素，苎麻纤维是纺织行业的重要原料，苎麻中的非纤维素成分被称为苎麻中的胶质，苎麻纤维素在原麻中与苎麻中的胶质粘连在一起，胶质残留会直接影响苎麻纤维的品质，如纤维粘结、纤维束分离性较差、手感糙涩，因此苎麻纤维投入纺织前的重要步骤之一就是脱胶，而传统的脱胶需要高温、高压、强酸、强碱等条件，不仅使得纤维遭到损坏，也对环境造成了极大的污染。

2、苎麻中的非纤维素包括脂蜡质、水溶物、果胶、半纤维素、木质素等，其中半纤维素含量最高。并且苎麻韧皮中的半纤维素主要包括半乳葡甘露聚糖、葡甘露聚糖和木聚糖，占比分别为45.5％、23.2％、8.4％。甘露聚糖酶(ec 3.2.1.78)是分解甘露聚糖的关键酶之一，通过随机切割甘露聚糖主链的β-1，4糖苷键将甘露聚糖分解成葡萄糖、甘露寡糖等低聚糖。甘露聚糖酶与果胶酶、木聚糖酶等联合使用可以去除苎麻中的胶质，对苎麻纤维的损害小，有利于提高苎麻织品的品质，减少废水排放，降低对环境的污染。

3、纺织工艺流程大都是在高温强碱的环境下进行，因此需要嗜热耐碱的甘露聚糖酶，但目前国内市场售卖甘露聚糖酶多为饲料用甘露聚糖酶，而纺织用甘露聚糖酶种类少且纺织用工业甘露聚糖酶有效ph大多在酸性范围内，例如夏盛工业级甘露聚糖酶的有效温度范围为30～70℃、有效ph为3.0～6.5，满足不了苎麻脱胶高温强碱的环境。嗜热耐碱的甘露聚糖酶因其在极端碱性和高温条件下具有优良的性质和重要的工业应用备受关注。

技术实现思路

1、基于此，本发明通过酶挖掘与改造技术获得一种嗜热耐碱的甘露聚糖酶，并将其用于苎麻脱胶工业降解苎麻的甘露聚糖，为苎麻脱胶工业复配酶制剂需求提供一种新选择。

2、本发明上述目的通过以下技术方案实现：

3、一种甘露聚糖酶，其氨基酸序列如seq id no:2所示。

4、本发明提供的嗜热耐碱的甘露聚糖酶，其最适温度为75℃，最适ph为10，并且能够在ph 7～12范围内保持稳定。在70℃，ph 10热碱条件下，本发明的甘露聚糖酶的半衰期是其对应的野生型甘露聚糖酶的3.9倍，其在苎麻脱胶工艺中具有更佳的应用价值，为苎麻脱胶复合酶制剂提供了一种新的优良的选择。

5、进一步，编码所述甘露聚糖酶的基因。

6、进一步，所述基因的核苷酸序列如seq id no:4所示。

7、进一步，包含所述基因的重组载体或重组菌株。

8、进一步，所述重组载体的表达载体包括以pet28a。

9、进一步，所述重组菌株的宿主包括大肠杆菌bl21(ed3)。

10、进一步，所述甘露聚糖酶的制备方法包括如下步骤：构建权利所述重组表达载体并转化至宿主细胞，获得重组表达菌株，对所述重组表达菌株进行培养、诱导表达、分离纯化，得到所述甘露聚糖酶。

11、进一步，所述构建重组表达载体包括如下步骤：

12、(1)筛选得到氨基酸序列如seq id no:1所示的甘露聚糖酶，合成对应的核苷酸序列并连接至表达载体，获得重组质粒，所述核苷酸序列如seq id no:3所示；

13、(2)以所述重组质粒为模板，设计突变引物，进行pcr扩增获得manb085m基因和pet-28a(+)骨架，对所述骨架进行dpni酶切，将酶切后的骨架与manb085m基因进行同源重组获得所述重组表达载体；

14、所述突变引物的引物序列序列如下：

15、manb085m-f：5’-agcaaatgggtcgcggatcccagacccatagcggctttta-3’；

16、manb085m-r：5’-tggtggtggtggtgctcgagatgaaaaatgctgctcggaa-3’；

17、pet-28a(+)-f：5’-ctcgagcaccaccaccaccaccactgagatccggctgcta-3’；

18、pet-28a(+)-r：5’-gcgacccatttgctgtccaccagtcatgctagccatatgg-3’。

19、本发明还提供所述甘露聚糖酶在苎麻脱胶中的应用。

20、进一步，所述甘露聚糖酶用于苎麻脱胶的温度为60～80℃，ph为7～12。

21、说明书附图

22、图1为本发明野生型甘露聚糖酶及突变型甘露聚糖酶的sds-page蛋白电泳图，其中孔道1是蛋白marker，孔道2是野生型甘露聚糖酶manb085，孔道3是突变型甘露聚糖酶manb085m。

23、图2为本发明野生型及突变型甘露聚糖酶的最适ph曲线。

24、图3为本发明野生型及突变型甘露聚糖酶的最适反应温度曲线。

25、图4为本发明野生型及突变型甘露聚糖酶的ph稳定性曲线。

26、图5为本发明野生型及突变型甘露聚糖酶在70℃下的半衰期曲线。

技术特征：

1.一种甘露聚糖酶，其特征在于，其氨基酸序列seq id no:2所示。

2.编码权利要求1所述甘露聚糖酶的基因。

3.如权利要求2所述基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列seq id no:4所示。

4.一种包含如权利要求2所述基因的重组表达载体或重组表达菌株。

5.如权利要求4所述的重组表达载体或重组表达菌株，其特征在于，所述重组表达载体的表达载体包括以pet28a。

6.如权利要求4所述的重组表达载体或重组表达菌株，其特征在于，所述重组表达菌株的宿主细胞包括大肠杆菌bl21(ed3)。

7.如权利要求1所述甘露聚糖酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：构建权利要求4或5所述重组表达载体并转化至宿主细胞，获得重组表达菌株，对所述重组表达菌株进行培养、诱导表达、分离纯化，得到所述甘露聚糖酶。

8.如权利要求7所述制备方法，其特征在于，所述构建重组表达载体包括如下步骤：

9.如权利要求1至8任一所述甘露聚糖酶在苎麻脱胶中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述甘露聚糖酶用于苎麻脱胶的温度为60～80℃，ph为7～12。

技术总结
本发明属于酶工程技术科学领域，公开一种甘露聚糖酶及其在苎麻脱胶中的应用。本发明采用大肠杆菌表达系统制备具有活性的甘露聚糖酶ManB085，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，通过将甘露聚糖酶ManB085截去301～464位氨基酸残基得到突变型甘露聚糖酶ManB085M，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明的甘露聚糖酶属于嗜热耐碱酶，其最适温度为75℃，最适pH为10，并且能够在pH 7～12范围内保持稳定。在70℃，pH 10热碱条件下，本发明的甘露聚糖酶的半衰期是其对应的野生型甘露聚糖酶的3.9倍，因此其在苎麻脱胶工艺中具有更佳的应用价值，为苎麻脱胶复合酶制剂提供了一种新选择。

技术研发人员：郑穗平,陈愫萍
受保护的技术使用者：华南理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/17